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技術(shù)文章
犬鉤端螺旋體試劑盒說明書
點(diǎn)擊次數(shù)：870 發(fā)布時(shí)間：2012-12-11
犬鉤端螺旋體試劑盒*，96T包裝?？蒲惺褂?。
原理
原理
采用定量夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)?？贵w具體為FGF6已經(jīng)被預(yù)先涂到微孔板。標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸入井和任何FGF6目前被綁定的固定化抗體。*共軛的抗體特異性FGF6除去任何未結(jié)合的物質(zhì)后，加入到孔中?？?蛋白共軛的辣根過氧化物酶（HRP）的洗滌后，加入到孔中。經(jīng)過洗滌，以除去任何未結(jié)合的抗*蛋白的酶試劑，底物溶液加入到孔中，顯色成比例的量的初始步驟中的約束的FGF6。彩色顯影被停止并測(cè)量的顏色的強(qiáng)度
檢測(cè)程序：
在使用前，將所有試劑和樣品室溫。再次離心樣品解凍后測(cè)定前。據(jù)建議，所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)定一式兩份。
1。準(zhǔn)備好所有試劑，工作標(biāo)準(zhǔn)和樣品在前面的章節(jié)中。
2。請(qǐng)確定井?dāng)?shù)的使用，并把任何剩余的井和入袋干燥劑，密封保鮮袋，將未使用的井在4°C的含量布局表
。每孔加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)和樣品。封面用膠粘帶提供。孵育2小時(shí)，在37℃下一盤布局記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品檢測(cè)。
4。每孔中取出的液體，不洗。
5。向每孔中加入100μl*抗體（1倍）。蓋上一個(gè)新的膠粘帶。為1小時(shí)孵育在37℃下（*抗體（1X）可能會(huì)出現(xiàn)混濁。預(yù)熱至室溫，輕輕混勻，直到出現(xiàn)均勻解決方案。）
6。吸液的各孔和洗滌，共洗滌三次重復(fù)該過程兩次。洗凈，每孔填充洗滌緩沖液（200μL）使用噴瓶，多道移液器，歧管器，或autowasher，和，靜置2分鐘，*清除液體的每一步是*的良好的性能。zui后一次洗滌后，清除任何剩余洗滌緩沖液的吸ordecanting。倒置板和涂抹對(duì)干凈的紙巾。
7。向每孔中加入100μl的HRP-抗*蛋白（1×）。量的微量滴定板，用一個(gè)新的粘接劑條。溫育1小時(shí)，在37℃下
8。重復(fù)的愿望/洗滌過??程中，在步驟6的5倍。
9。將90μlTMB底物添加到每個(gè)孔中。孵育15-30分鐘，在37℃下避光
10。一站式解決方案，每孔加入底物，輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板，以確保充分混合。
11。在5分鐘內(nèi)，設(shè)置至450nm，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度。如果波長(zhǎng)校正，設(shè)置為540nm或570nm處。在540nm或570nm波長(zhǎng)在450nm處的讀數(shù)減去讀數(shù)。該減法校正板的光學(xué)缺陷。在450nm處未經(jīng)修正讀數(shù)直接，可能會(huì)比較高，不太準(zhǔn)確。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。
檢測(cè)程序：
在使用前，將所有試劑和樣品室溫。再次離心樣品解凍后測(cè)定前。據(jù)建議，所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)定一式兩份。
1。準(zhǔn)備好所有試劑，工作標(biāo)準(zhǔn)和樣品在前面的章節(jié)中。
2。請(qǐng)確定井?dāng)?shù)的使用，并把任何剩余的井和入袋干燥劑，密封保鮮袋，將未使用的井在4°C的含量布局表
。每孔加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)和樣品。封面用膠粘帶提供。孵育2小時(shí)，在37℃下一盤布局記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品檢測(cè)。
4。每孔中取出的液體，不洗。
5。向每孔中加入100μl*抗體（1倍）。蓋上一個(gè)新的膠粘帶。為1小時(shí)孵育在37℃下（*抗體（1X）可能會(huì)出現(xiàn)混濁。預(yù)熱至室溫，輕輕混勻，直到出現(xiàn)均勻解決方案。）
6。吸液的各孔和洗滌，共洗滌三次重復(fù)該過程兩次。洗凈，每孔填充洗滌緩沖液（200μL）使用噴瓶，多道移液器，歧管器，或autowasher，和，靜置2分鐘，*清除液體的每一步是*的良好的性能。zui后一次洗滌后，清除任何剩余洗滌緩沖液的吸ordecanting。倒置板和涂抹對(duì)干凈的紙巾。
7。向每孔中加入100μl的HRP-抗*蛋白（1×）。量的微量滴定板，用一個(gè)新的粘接劑條。溫育1小時(shí)，在37℃下
8。重復(fù)的愿望/洗滌過??程中，在步驟6的5倍。
9。將90μlTMB底物添加到每個(gè)孔中。孵育15-30分鐘，在37℃下避光
10。一站式解決方案，每孔加入底物，輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板，以確保充分混合。
11。在5分鐘內(nèi)，設(shè)置至450nm，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度。如果波長(zhǎng)校正，設(shè)置為540nm或570nm處。在540nm或570nm波長(zhǎng)在450nm處的讀數(shù)減去讀數(shù)。該減法校正板的光學(xué)缺陷。在450nm處未經(jīng)修正讀數(shù)直接，可能會(huì)比較高，不太準(zhǔn)確。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。
| 800pmol/L | 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 400pmol/L | 4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 200pmol/L | 3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 100pmol/L | 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 50pmol/L | 1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
計(jì)算結(jié)果：
建議使用專業(yè)的軟“曲線專家1.3”的標(biāo)準(zhǔn)曲線，這可以從我們的下載。
平均每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品的重復(fù)讀數(shù)和平均減去零標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)密度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過減少使用能產(chǎn)生四參數(shù)邏輯（4-PL）的曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件的數(shù)據(jù)。作為一種替代方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)在y-軸的濃度通過繪制在x-軸為每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度，并繪制一個(gè)通過在曲線圖上的點(diǎn)的*擬合曲線。該數(shù)據(jù)可以通過繪制的FGF6濃度與日志的OD值和*擬合直線的日志，可以通過回歸分析確定線性化。此過程會(huì)產(chǎn)生足夠的，但不太的適合的數(shù)據(jù)。
如果已稀釋的樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的濃度必須乘以稀釋因子。