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技術(shù)文章

犬抗Q熱抗體ELISA試劑盒原理

點(diǎn)擊次數(shù):390 發(fā)布時(shí)間:2012-6-27

  Elisa試驗(yàn)是一種敏感性高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果判斷較客觀等因素,已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。ELISA檢測(cè)試劑盒是用于體外定性檢測(cè)人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎(HEV)病毒IgM抗體ELISA檢測(cè)。
  

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犬抗Q熱抗體ELISA試劑盒原理
  本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中犬抗Q熱抗體ELISA試劑盒平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入抗Q熱抗體ELISA試劑盒再與HRP標(biāo)記的抗Q熱抗體ELISA試劑盒體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抗Q熱抗體ELISA試劑盒呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中犬抗Q熱抗體ELISA試劑盒濃度。
注意事項(xiàng):

1、做好對(duì)照

  正式試驗(yàn)時(shí),應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高,說(shuō)明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2、實(shí)驗(yàn)條件的選擇 

  在ELISA中,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,其中包括:(1)固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。(2)包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí),要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18~24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后,在其它試驗(yàn)條件相同時(shí),觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1~10μg/ml。(3)酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。(4)酶的底物及供氫體的選擇:對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后,應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入?!?/p>

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