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　　原理
　　
　　此法采用定量夾心酶聯(lián)免疫技術?？贵w具體為NRP1已經(jīng)被預先涂到微孔板。標準和樣品吸入井和任何的NRP1目前的固定化抗體的約束。*共軛的抗體特異性NRP1除去任何未結合的物質后，加入到孔中?？?蛋白共軛的辣根過氧化物酶（HRP）的洗滌后，加入到孔中。經(jīng)過洗滌，以除去任何未結合的抗*蛋白的酶試劑，底物溶液加入到孔中，并顏色發(fā)展成比例的量的初始步驟中NRP1綁定。彩色顯影被停止并測量的顏色的強度。
　　
　　精度
　　
　　批內精密度（內檢測精度）：CV％<8％
　　
　　三種已知濃度的樣品進行了測試20次在一個平板上進行評估。
　　
　　間精密度（精密檢測間）：CV％<10％
　　
　　已知的三個樣本20檢測到的濃度進行了測試評估。
　　
　　樣品采集和存儲
　　
　　血清：使用血清分離管（SST）和全血標本在室溫下兩小時或4℃過夜℃，然后離心15分鐘，在1000×g下。刪除上清即可檢測，或分裝和店內樣品在-20°C或-80°C。但應避免反復凍融循環(huán)。
　　
　　等離子：采集血漿中EDTA或肝素作為抗凝血劑。在2-8°C在30分鐘內收集離心15分鐘，1000×G。即可檢測，或分裝保存樣本在-20°C或-80°C。但應避免反復凍融循環(huán)。
　　
　　檢測程序
　　
　　在使用前，將所有試劑和樣品室溫。再次離心樣品解凍后測定前。據(jù)建議，所有樣品和標準來測定一式兩份。
　　
　　1。準備好所有試劑，工作標準和樣品在前面的章節(jié)中。
　　
　　2。請確定井數(shù)的使用，并把任何剩余的井和入袋干燥劑，密封保鮮袋，將未使用的井在4°C的含量布局表
　　
　　。每孔加入100μl的標準和樣品。封面用膠粘帶提供。孵育2小時，在37℃下一盤布局記錄標準和樣品檢測。
　　
　　4。每孔中取出的液體，不洗。
　　
　　5。向每孔中加入100μl*抗體（1倍）。蓋上一個新的膠粘帶。孵育1小時，在37℃下（*抗體（1X）可能會出現(xiàn)混濁。預熱至室溫，輕輕混勻，直到出現(xiàn)均勻解決方案。）
　　
　　6。吸液的各孔和洗滌，共洗滌三次重復該過程兩次。洗凈，每孔填充洗滌緩沖液（200μL）使用噴瓶，多道移液器，歧管器，或autowasher，和，靜置2分鐘，*清除液體的每一步是*的良好的性能。zui后一次洗滌后，清除任何剩余洗滌緩沖液的吸ordecanting。倒置板和涂抹對干凈的紙巾。
　　
　　7。向每孔中加入100μl的HRP-抗*蛋白（1×）。量的微量滴定板，用一個新的粘接劑條。溫育1小時，在37℃下
　　
　　8。重復的愿望/洗滌過??程中，在步驟6的5倍。
　　
　　9。將90μlTMB底物添加到每個孔中。孵育15-30分鐘，在37℃下避光
　　
　　10。一站式解決方案，每孔加入底物，輕輕晃動酶標板，以確保充分混合。
　　
　　11。在5分鐘內，設置至450nm，使用酶標儀測定各孔的光密度。如果波長校正，設置為540nm或570nm處。在540nm或570nm波長在450nm處的讀數(shù)減去讀數(shù)。該減法校正板的光學缺陷。在450nm處未經(jīng)修正讀數(shù)直接，可能會比較高，不太準確。
　　
　　計算結果
　　
　　建議使用專業(yè)的軟“曲線專家1.3”的標準曲線，這可以從我們的下載。
　　
　　平均每個標準和樣品的重復讀數(shù)和平均減去零標準的光學密度。
　　
　　標準曲線，通過減少使用能產(chǎn)生四參數(shù)邏輯（4-PL）的曲線擬合的計算機軟件的數(shù)據(jù)。作為一種替代方法，建立標準曲線，對在y-軸的濃度通過繪制在x-軸為每個標準的平均吸光度，并繪制一個通過在曲線圖上的點的*擬合曲線。該數(shù)據(jù)可以通過繪制與日志的OD值和*擬合直線的NRP1濃度的日志，可以通過回歸分析確定線性化。此過程會產(chǎn)生足夠的，但不太的適合的數(shù)據(jù)。
　　
　　如果已稀釋的樣品，從標準曲線上讀出的濃度必須乘以稀釋因子。

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