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人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）酶聯(lián)免疫檢測
點(diǎn)擊次數(shù)：376 發(fā)布時間：2013-7-25
人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）酶聯(lián)免疫檢測
試劑盒使用說明書
使用前仔細(xì)閱讀本說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于*雙抗體夾心技術(shù)原理，來檢測人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）），只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。
用 途： 用于人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）的測定。
工作原理
本試劑盒采用的是*雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）的水平。向預(yù)先包被了人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3），溫育；溫育后，加入*標(biāo)記的抗TIMP-3抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）的濃度呈正相關(guān)。
試劑盒組成
1 | 標(biāo)準(zhǔn)品（48ng/ml） | 0.5ml | 7 | 顯色劑A液 | 6ml |
2 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 3ml | 8 | 顯色劑B液 | 6ml |
3 | 酶標(biāo)包被板 | 12孔×8條 | 9 | 終止液 | 6ml |
4 | 鏈霉親和素-HRP | 6ml | 10 | 說明書 | 1份 |
5 | 30倍濃縮洗滌液 | 20ml | 11 | 封板膜 | 2張 |
6 | *標(biāo)記的抗- TIMP-3抗體 | 1ml | 12 | 密封袋 | 1個 |
需要而未提供的試劑和器材
- 37℃恒溫箱。
- 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
- 精密移液器及一次性吸頭
- 蒸餾水，
- 一次性試管
- 吸水紙
注意事項(xiàng)
- 從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
- 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。
- 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
- 為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
- 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
- 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
標(biāo)本要求
1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
操作程序
- 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：
24ng/ml | （5號標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
12ng/ml | （4號標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
6ng/ml | （3號標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
3ng/ml | （2號標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
1.5ng/ml | （1號標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
- 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
- 加樣：1）空白孔：空白對照孔不加樣品，*標(biāo)記的抗TIMP-3抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl，*-HRP50μl（標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好*抗體，故不加）；3）待測樣品孔:加入樣本40μl，然后各加入抗- TIMP-3抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60分鐘。
- 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)4次，拍干。
- 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
- 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
- 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
9.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。
操作程序總結(jié)：
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，*標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)60分鐘
洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘
加入終止液
10分鐘之內(nèi)讀OD值
計(jì)算
檢測范圍：0.1ng/ml→40ng/ml。
規(guī)格： 96T/盒
保存： 2-8℃
有效期： 6個月（2-8℃）。