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小鼠胚胎干分離自囊胚胚胎組織；胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESCs，簡稱ES、EK或ESC細胞）是早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細胞都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。進一步說，胚胎干細胞（ES細胞）是一種高度未分化細胞。它具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)結構，細胞核大，有一個或幾個核仁，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)胞漿少，結構簡單。體外培養(yǎng)時，細胞排列緊密，呈集落狀生長。用堿性磷酸酶染色，ES細胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細胞呈淡黃色。細胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細胞彼此界限不清，細胞表面有折光較強的脂狀小滴。細胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀。小鼠ES細胞的直徑7 微米～18 微米，豬、牛、羊ES細胞的顏色較深，直徑12 微米～18 微米。胚胎干細胞與普通細胞有顯著差別，有其特定的生長特性和特定的標志，例如堿性磷酸酶活性非常高，帶有胚胎階段特異性表面抗原（ Stage- specific embryonic antigens,SSEA），人類胚胎干細胞還帶有高分子量的糖蛋白TRA1-60、TRA-1-81等標志，這些特性和標志均可以用于對胚胎干細胞進行鑒定，除此之外，胚胎干細胞還可以在體外傳代，并保持正常核型。在體外培養(yǎng)體系中加入分化抑制劑如白血病抑制因子（ Leukaemia inhibitory factor,LF）或者在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層（MEF）上培養(yǎng)時，胚胎干細胞都能呈克隆性增殖，長期保持核型正常和穩(wěn)定，凍存解凍也不影響不分化的特性。另外，胚胎干細胞還表現(xiàn)岀高水平端粒酶活性，目前證明端粒酶與細胞衰老密切相關，多數(shù)成熟細胞的端粒酶活性都很低。這些都是胚胎干細胞與成熟細胞不同的重要特點，也可能是其復制生命期限遠比體細胞長的原因。
方法簡介：

公司實驗室分離的小鼠胚胎干采用分離囊胚組織，去除胚胎透明帶、使用特制專用培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，消化傳代純化制備而來，細胞總量約為5×105cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實驗室分離的小鼠胚胎干經(jīng)Oct-4免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

包被條件 明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含LIF、BMP、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次；

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 短梭形、多角形

傳代特性 可傳5-8代左右

消化液 0.025%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

準備工作

1. 實驗器材準備：準備無菌的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、移液管、離心管、手術器械等，并進行高壓滅菌或其他合適的消毒處理。

2. 試劑準備：配制或購買合適的培養(yǎng)基、消化酶（如、膠原酶等）、胎牛血清、雙抗等試劑，確保其無菌且在有效期內(nèi)。

3. 實驗動物或組織來源準備：根據(jù)實驗需求，選擇合適的動物并進行相應的麻醉或處死，獲取所需組織；或從已有的組織樣本庫中獲取組織。

取材與處理

1. 取材：在無菌條件下，迅速取出目標組織，盡量減少對組織的損傷，并去除多余的脂肪、結締組織等非目的組織。

2. 清洗：將取出的組織用預冷的無菌PBS沖洗數(shù)次，以去除血液和雜質(zhì)。

3. 剪切：將組織剪成約1 - 2mm3的小塊，以便后續(xù)消化。

細胞分離

1. 消化：將剪碎的組織塊放入含有適量消化酶的離心管中，在37℃恒溫搖床或培養(yǎng)箱中消化一段時間。期間可輕輕搖晃離心管，使消化更均勻。

2. 終止消化：當組織塊大部分被消化成單細胞懸液或小細胞團時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 過濾與離心：用細胞篩過濾細胞懸液，去除未消化的組織碎片，然后將濾液以適當?shù)霓D(zhuǎn)速離心，收集細胞沉淀。

細胞觀察與檢測

1. 日常觀察：每天用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)、密度等，記錄細胞的變化情況，如發(fā)現(xiàn)細胞污染或異常，及時采取相應措施。
2. 細胞計數(shù)與活力檢測：在需要時，可采用臺盼藍染色等方法對細胞進行計數(shù)和活力檢測，以了解細胞的生長情況和健康狀態(tài)。

一、取材與分離

1. 快速操作

- 組織取材后需立即處理，避免長時間暴露于室溫或非營養(yǎng)環(huán)境。

- 使用無菌 PBS 或生理鹽水沖洗組織，去除血液、雜質(zhì)。

2. 消化酶選擇

- 根據(jù)組織類型選擇消化酶，避免過度消化導致細胞損傷。

- 消化時間需嚴格控制（通常 10-30 分鐘），可通過顯微鏡觀察細胞解離狀態(tài)。

二、培養(yǎng)條件優(yōu)化

1. 培養(yǎng)基選擇

- 使用含血清或特定生長因子的培養(yǎng)基（如 DMEM、RPMI 1640 等），部分細胞需添加胰島素、EGF 等。

- 避免頻繁更換培養(yǎng)基品牌或批次，減少細胞適應壓力。

2. 貼壁與傳代

- 原代細胞貼壁能力較弱，可能需要包被培養(yǎng)皿（如膠原蛋白、多聚賴氨酸）。

- 傳代時密度建議控制在 70%-80%，過度匯合會導致接觸抑制和分化。

三、污染控制

1. 無菌操作

- 全程在超凈臺操作，使用一次性耗材，避免交叉污染。

- 培養(yǎng)基中可添加雙抗，但長期使用可能影響細胞活性。

2. 支原體檢測

- 定期檢測支原體污染（如 PCR 法），污染后需及時丟棄細胞。

四、狀態(tài)監(jiān)控

1. 日常觀察

- 每天檢查細胞形態(tài)、密度及培養(yǎng)基顏色，及時更換培養(yǎng)基（通常每 2-3 天換液一次）。

- 異常形態(tài)（如細胞變圓、碎片增多）可能提示污染或營養(yǎng)不足。

2. 傳代與凍存

- 原代細胞分裂次數(shù)有限（一般 5-10 代），需及時凍存早期代次細胞。

- 凍存液建議使用 DMSO+血清（或?qū)Ｓ脙龃媾囵B(yǎng)基），梯度降溫后液氮保存。