這次和大家探討一些關(guān)于HPLC方法學(xué)開發(fā)的問(wèn)題。當(dāng)然，這是很久以前的思路，在今天看來(lái)是比較幼稚的，但是，如果能夠給大家一點(diǎn)哪怕一點(diǎn)點(diǎn)啟示也是好的。當(dāng)然文章有很多缺陷，也希望大家批評(píng)。

液相色譜在極性的角度可以分成正相色譜分析和反相色譜分析。反相色譜分析一般使用水-甲醇-乙腈體系，一般選用C8，C10，C18 柱子，主要使用C18鍵合相柱子。非極性物質(zhì)一般用氯方-正己烷體系。因?yàn)閝ingqingcao沒有做過(guò)正相HPLC分離，所以，我們主要關(guān)注反相HPLC分析。

色譜柱的選擇

當(dāng)然，選用的色譜柱一般就是C18柱。長(zhǎng)度呢？如果分析的物質(zhì)復(fù)雜，那么可以選取長(zhǎng)一些的，比如250mm╳4.6mm╳5μm。保證其分離度。 如果物質(zhì)不是很復(fù)雜，那么選取150mm╳4.6mm╳5μm的色譜柱，可以有效地縮短分析時(shí)間。

檢測(cè)器的選擇

紫外檢測(cè)器是zui通用的檢測(cè)器之一，所以，本文均以紫外檢測(cè)器做說(shuō)明。對(duì)于需要分析的物質(zhì)，做全波長(zhǎng)掃描，由于物質(zhì)的不同官能團(tuán)，他們會(huì)在不同的地方有吸收。通過(guò)綜合選取大家都有吸收的波長(zhǎng)。選擇波長(zhǎng)需要有權(quán)衡。同時(shí)也可以用一些特殊的波長(zhǎng)，避免雜質(zhì)的吸收，也可以提升測(cè)試準(zhǔn)確度。或者使用雙波長(zhǎng)的方法。

流動(dòng)相的選擇

對(duì)于選取流動(dòng)相，首先實(shí)驗(yàn)一下樣品的溶解度。樣品在水中，甲醇，乙腈中溶解程度。如果，很容易溶解在水中，這就告訴我們，流動(dòng)相選取，可能有機(jī)相要少些，比方說(shuō)測(cè)試*，其極性很強(qiáng)，流動(dòng)相中有機(jī)相比例不能多。（為了保護(hù)色譜柱，有機(jī)相比例一般不少于8% ）如果，樣品不太容易溶解在水中，那么有機(jī)相的比例應(yīng)高些，比方像*，就可以用90% -95% 的甲醇體系。

其次是樣品的酸堿度。我們知道，C18色譜柱流動(dòng)相pH在2-8 之間。太酸，太堿都可能損壞色譜柱。流動(dòng)相pH值對(duì)于分離有一定作用，所以，酸性物質(zhì)，一般流動(dòng)相酸一些，堿性物質(zhì)可能堿一些。

對(duì)于幾種物質(zhì)的分離。如果不是太多的物質(zhì)，用等度方法會(huì)比較好。流動(dòng)相一般開始選用20mM磷酸緩沖鹽-乙腈體系。（pH一定，流速一定）。因?yàn)橐译嫦疵摵?，而且粘度低。通過(guò)水相-有機(jī)相的比例的改變，觀察各色譜峰的分離情況。這樣可以運(yùn)用無(wú)限夾逼法找到zui合適的值。比方說(shuō)，35：65（ACN：磷酸鹽）達(dá)到分離，但是還是有部分疊加，那么就微調(diào)即可。當(dāng)然還要考慮到分析時(shí)間問(wèn)題。不要為了*分離而犧牲了分析時(shí)間。所以，在色譜分析，有一個(gè)k值（容量因子）。κ∈（2，20）

如果真的無(wú)法改變，那么可以試著微調(diào)pH值，來(lái)分離。當(dāng)然，由于乙腈毒性強(qiáng)，所以通過(guò)一定計(jì)算，用甲醇同等地接替乙腈。

如果有些物質(zhì)很靠近死體積，那么需要考慮添加0.02mM離子對(duì)試劑，加強(qiáng)物質(zhì)的保留能力。

流速

一般液相流速在0.8-1.4ml/min。shou選1.0ml/min

柱溫

柱溫不影響色譜的分離，但是，相對(duì)穩(wěn)定的溫度，可以使得保留時(shí)間穩(wěn)定。

進(jìn)樣量

手動(dòng)進(jìn)樣，只有進(jìn)樣環(huán)。一般也就是20μL。自動(dòng)進(jìn)樣的選擇很多。但是，zuihao不要超過(guò)80μL。因?yàn)檫M(jìn)樣多，容易造成展寬。

分離物質(zhì)的濃度

分離物質(zhì)，不能夠太濃也不能太稀。太濃，容易過(guò)載；太稀檢測(cè)不出。具體還是根據(jù)檢測(cè)器的響應(yīng)來(lái)調(diào)整。

小結(jié)

HPLC分析，首先要找到合適的流動(dòng)相。流動(dòng)相既要保證分離，又要關(guān)心分析時(shí)間。流動(dòng)相盡量使用毒性小一點(diǎn)的甲醇。根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的PH值進(jìn)行調(diào)節(jié)流動(dòng)相溶液酸堿度。

檢測(cè)波長(zhǎng)很重要，要懂得合適的波長(zhǎng)。也就是說(shuō)，這個(gè)單一波長(zhǎng)可以分析出所有需要分析的物質(zhì)。可以通過(guò)波長(zhǎng)的調(diào)整，規(guī)避雜質(zhì)峰的干擾。

溫度和流速都對(duì)分離，影響不大。

分離條件摸索好后，就可以開展

1）線性濃度測(cè)試

2）精密度測(cè)試

3）樣品測(cè)試

4）回收率測(cè)試

5）空白測(cè)試。

6）zui小檢測(cè)限，zui小檢測(cè)量

定量的工作比較簡(jiǎn)單，就是按照以上的思路去操作。那么一個(gè)項(xiàng)目就這么完成了。當(dāng)然，這些需要我們的工程師們的努力和智慧。我希望寫的這些東西，能夠給初學(xué)者一點(diǎn)點(diǎn)啟示，當(dāng)然，如果有錯(cuò)誤的話，希望不會(huì)誤導(dǎo)大家。

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