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蛋白芯片技術(shù)的基本原理與技術(shù)的研究現(xiàn)狀

2010年11月20日 09:42:50人氣:1564來源:上海源葉生物科技有限公司

隨著分子生物學(xué)芯片技術(shù)研究工作的進一步深入開展,DNA芯片技術(shù)已經(jīng)被逐漸應(yīng)用于對生物樣品中的各種已知或未知的核酸序列表達的檢測和比較研究。但是,作為生物體細胞中實施化學(xué)反應(yīng)功能成分的蛋白質(zhì),其相當部分與活性基因所表達的mRNA之間未能顯示出直接的關(guān)系,因此使作為高通量基因表達分析平臺的cDNA芯片技術(shù)的應(yīng)用過程受到一定的限制。另外,由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象方面的各種微小的化學(xué)變化均能引起活性或功能的改變,為了進一步揭示細胞內(nèi)各種代謝過程與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系以及某些疾病發(fā)生的分子水平的機制,必須對蛋白質(zhì)的功能進行更深入的研究。隨著DNA芯片技術(shù)的不斷成熟以及基因研究所取得的令人矚目的成果,進一步推動了蛋白質(zhì)功能的研究及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,蛋白芯片技術(shù)也就應(yīng)運而生。

蛋白芯片技術(shù)的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片,然后,用標記了特定熒光抗體的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用,經(jīng)漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補結(jié)合的成分洗去,再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù),測定芯片上各點的熒光強度,通過熒光強度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系,由此達到測定各種蛋白質(zhì)功能的目的。為了實現(xiàn)這個目的,首先必須通過一定的方法將蛋白質(zhì)固定于合適的載體上,同時能夠維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象,也就是必須防止其變性以維持其原有特定的生物活性。另外,由于生物細胞中蛋白質(zhì)的多樣性和功能的復(fù)雜性,開發(fā)和建立具有多樣品并行處理能力、能夠進行快速分析的高通量蛋白芯片技術(shù)將有利于簡化和加快蛋白質(zhì)功能研究。

在多年的蛋白芯片技術(shù)的研究過程中,研究者為了尋找合適的物質(zhì)作為蛋白的載體進行了不懈的探索。例如日本學(xué)者利用含有陽離子表面活性劑(HTAB)脂質(zhì)體作為載體,通過戊二醛作用使其與一種鐵蛋白包裹外殼的成分結(jié)合組裝制備成一種納米水平的裝配體,這種裝配體可以在適當?shù)膒H條件下使鐵蛋白分子進入并固定于包裹外殼內(nèi)面,形成蛋白質(zhì)的載體。有人利用某些固體表面或覆蓋上含有電解質(zhì)的薄膜作為載體,可以將膠體蛋白質(zhì)顆粒成分轉(zhuǎn)移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因組序列全長度閱讀框架編碼各種蛋白質(zhì)的相互作用時,使用不同孔數(shù)的平板作為載體,建立了約含有6 000個酵母轉(zhuǎn)化株組成的平板蛋白芯片系統(tǒng),平板上的每一個小孔中含有一個酵母轉(zhuǎn)化株,可以根據(jù)其活性功能區(qū)開放閱讀框架的編碼表達生成一種蛋白質(zhì),這個系統(tǒng)可以用于蛋白質(zhì)功能的檢測和分析。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝膠板作為支持物,將蛋白樣品置于凝膠上,然后經(jīng)過電泳分離,使其成為蛋白的陣列用于進一步的研究。zui近,哈佛大學(xué)蛋白芯片研究中心Gavin等利用制備DNA芯片的高精密度機械手的針狀點樣槍頭在只有顯微鏡載玻片一半大小的玻片上,制備了第1張含有樣品點數(shù)為10 800的蛋白芯片。這張芯片用已純化的蛋白G按每點為1納升的點樣量點樣10 799次,另一次用FRB(FK-BRl2—rapamycinbinding domain Of FKBP-rapamycin-associatedprotein)點樣。為了確保不同分子量的點樣蛋白質(zhì)都能夠被固定在玻片上,他們首先在玻片表面涂上BSA,然后使用N,N,—二琥珀酰胺碳酸(N,N’—disuccinimidyl carbonate)激活BSA表面的賴氨酸、天冬氨酸和*殘基成為BSA-NHS玻片,其作用是促進BSA與點樣蛋白質(zhì)的結(jié)合而使蛋白質(zhì)被固定于玻片上。在制備芯片過程中,為了保證被固定在載體上的蛋白質(zhì)依然保持天然的構(gòu)象和生物學(xué)活性,他們在蛋白質(zhì)點樣的磷酸鹽緩沖液中加入40%的甘油,以防止因水分的蒸發(fā)而造成蛋白質(zhì)變性。點樣后再經(jīng)3h的溫浴并將芯片浸泡于含有小牛血清蛋白(BSA)的緩沖液中,使芯片表面含有一層小牛血清蛋白,用于封閉與其他蛋白質(zhì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合的部位及在表面未參加反應(yīng)的醛基。為了檢測芯片的應(yīng)用,他們用不同熒光抗體分別標記能與蛋白G和FRB特異結(jié)合的IgG和FKBPl2(12Kd FK506—bindingprotein)并作用于蛋白芯片,觀察這些蛋白質(zhì)與蛋白芯片的相互作用,其結(jié)果清晰地顯示芯片上的蛋白G和單一的FRB點樣分別被標上藍色和紅色熒光。該實驗研究建立了蛋白質(zhì)樣品微量點樣技術(shù)并使蛋白質(zhì)固定于載體上時能夠保留原有的構(gòu)象和生物學(xué)活性,這為今后對蛋白質(zhì)多樣品的并行研究或快速分析——為制備高通量功能檢測的蛋白芯片奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

 

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