細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時檢查，到細(xì)胞形成克隆時終止培養(yǎng)。

1、平板克隆形成試驗

基本步驟：

（1）取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%*消化并吹打成單個細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。

（2）將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度（根據(jù)增殖能力）接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、200個細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。

（3）經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

（4）將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。zui后計算克隆形成率。

克隆數(shù)

克隆形成率= —————×100%

接種細(xì)胞數(shù)

平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團，接種密度不能過大。

2、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗

基本步驟：

（1）取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%*消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。

（2）用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。

（3）按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基（含有2×抗生素和20%的小牛血清）混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中（10cm平皿加7～10mL），冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

（4）按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天。

（5）把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計算形成率。

軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗中瓊脂與細(xì)胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。

提示：本文軟瓊脂克隆形成實驗屬于生化實驗文章，主要介紹軟瓊脂、克隆形成方面的知識，內(nèi)容僅供學(xué)習(xí)交流與參考。

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