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沙門(mén)菌病核酸探針檢測(cè)方法

2011年05月28日 11:39:18人氣:1711來(lái)源:上海銳谷生物科技有限公司

核酸探針 Fitts(1983)等在沙門(mén)菌檢測(cè)中引入了*代DNA-RNA雜交技術(shù),此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門(mén)菌DNA片段,其敏感性高,經(jīng)大約48h的增菌步驟后,檢測(cè)極限可達(dá)l08個(gè)/ml,但由于要使用放射性同位素,只能在專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,因此阻礙了該方法的推廣應(yīng)用。第二代方法依賴于沙門(mén)菌核糖體RNA(rRNA)的檢測(cè)。核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分,每個(gè)細(xì)菌中存在5000~20000個(gè)復(fù)制體,而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅2~10個(gè)。

這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得*檢測(cè)成為可能,同時(shí)又保持了與放射性同位素方法相當(dāng) 或更高的敏感性。該方法的另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈,雜交前無(wú)需經(jīng)過(guò)變性步驟。要得到陽(yáng)性結(jié)果,此法需要105個(gè)/ml(以靶細(xì)胞計(jì))。對(duì)于沙門(mén)菌檢測(cè)來(lái)說(shuō),無(wú)論采取*代還是第二代檢測(cè)方法,都需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌,總共約50h。核酸探針?lè)ū菶LISA法更耗時(shí),但二者成本相近。檢測(cè)一種菌就需要制備一種探針,目前尚未建立所有致病性沙門(mén)菌的探針,無(wú)論是采用*代還是第二代檢測(cè)方法,要達(dá)到檢測(cè)量還要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌,任何一種方法不可能有100%的特異性和敏感性,所以必須考慮假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題。

AOACzui近認(rèn)可了Gene-Trak沙門(mén)菌比色分析法,探針的標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素(FITC),再用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗FITC的抗體結(jié)合放大探針,在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上雜交,對(duì)239株沙門(mén)菌的特異性檢出率為100%,假陽(yáng)性率為0.8%。
 

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