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染料法熒光PCR的數(shù)據(jù)與探針法的相比,除了擴增曲線之外,還增加了熔解曲線分析。如何確定數(shù)據(jù)是好是壞?好的話,數(shù)據(jù)可以使用;壞的話,需要查明原因,擬定下一步的體系優(yōu)化方案。這里探討如何確定數(shù)據(jù)是好是壞,如果不好,查明原因,如何擬定下一步的優(yōu)化方案。
熔解曲線分析
熔解曲線分析是在定量PCR中常用的一種定量測定方法。
原理:由于在PCR定量分析中利用的是在低溫復(fù)性後,擴增產(chǎn)物會按堿基互補配對原則結(jié)合成DNA雙鏈,而有的熒光素在與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生活化,能產(chǎn)生熒 光效應(yīng)。但由于反應(yīng)中存在少量的非特異聚合體(如引物二聚體等),能引起干擾,但非特異聚合體的熔解溫度較特異性結(jié)合低,當(dāng)擴增結(jié)束後,再緩慢加溫,當(dāng) DNA變性後,染料被釋放,熒光減少,而非特異性結(jié)合先于特異性結(jié)合減少,對熔解過程進行連續(xù)動態(tài)監(jiān)測可得熔解曲線,通過曲線將非特異性訊號和特異性訊號 區(qū)分出來,同時對特異性訊號區(qū),熒光減少的快慢與濃度的對數(shù)成正比。
目的:減小非特異性結(jié)合和引物二聚體的影響。用導(dǎo)數(shù)來提高分析率。
用途:除正常測定外,可用來進行突變分析。
方法:1.在擴增完後,緩慢升高溫度,同時對熒光進行連續(xù)監(jiān)測,可以得到如下曲線:t1是擴增終點,t2是非特異性結(jié)合分離點,t3是DNA開始變性點。
2.分析上圖可知,t3以後是特異結(jié)合分離區(qū),其熒光下降速度與終點擴增的基因成正比,但因為擴增是按等比數(shù)列增長,因此實際上是特異結(jié)合分離區(qū)熒光下降速度與樣本含量的對數(shù)成正比。由公式可得出標(biāo)本濃度。
優(yōu)點:熔解曲線法定量PCR,排除非特異性結(jié)合的干擾,提高了測定的準(zhǔn)確性和靈敏度,同時還能用于基因突變的分析。(原理:含突變位點的基因結(jié)合較正?;虿环€(wěn)定)
以下面的數(shù)據(jù)為例,通過熔解曲線和擴增曲線相結(jié)合,來介紹染料法熒光PCR數(shù)據(jù)分析的簡單流程。
舉例一、選取同一個基因,先看擴增曲線(RN VS CYCLER):
擴增曲線成s 型,形態(tài)可以;再看擴增曲線(Delta RN VS CYCLER):
Delta RN VS CYCLER 的擴增曲線形態(tài)也是比較標(biāo)準(zhǔn)的;二者都很正常時,再轉(zhuǎn)向熔解曲線, 這時,我們發(fā)現(xiàn)熔解曲線不太正常。
熔解曲線比較雜亂,有的溶解曲線是雙峰,有的熔解曲線是單峰,report 表示,有的tm在85度,有的是在89度。峰的位置也不相同。需要仔細分析,通過復(fù)孔,陰性對照等來分析數(shù)據(jù)。疑問是:產(chǎn)物是否相同?不同Tm的報告是真實的還是儀器的一種誤差?
值得提醒的是,不同儀器的report 結(jié)果不同,如ABI 的7000系列,只report 主要的tm;;而rotorgene 系列,則會報告每一個小峰的tm。
仔細看每個孔,選取其中正確的熔解曲線:
正確的熔解曲線:在某一特定溫度處有尖銳的單峰,該峰所在的溫度Tm,一般與引物設(shè)計及合成時的預(yù)測值比較接近。從樣本的角度,即采用了什么樣得樣本,孔 位置的角度(這幾個結(jié)果好的樣本孔是否相連,是否位于擴增儀的同排或者同列的位置),復(fù)孔的情況是否相似;操作的角度來進行分析和判斷;
正確的熔解曲線的數(shù)據(jù),它的CT值是可以用的,可以進行成對的數(shù)據(jù)分析,如進行Δct分析。
不正確的熔解曲線的數(shù)據(jù),要分析形成的原因。
選擇熔解曲線結(jié)果不好的孔,來分析:
這幾個孔的熔解曲線出現(xiàn)了雙峰,甚至三峰;峰的位置是否相同;結(jié)果是否可以認(rèn)為是類似的原因造成的? *峰的位置和第二峰的位置是否可以認(rèn)為是一樣的;通過調(diào)整程序是否能降低非特異反應(yīng)?
復(fù)孔的情況怎么樣:
分析所有復(fù)孔情況,看結(jié)果是否吻合。上圖的這個熔解曲線是復(fù)孔的熔解曲線,這樣可以說明,在一定程度存在非特異擴增的時候,第二峰的tm可能有一定差異;而這是兩個相同樣本的結(jié)果。而熔解曲線結(jié)果比較好的時候,復(fù)孔的結(jié)果也是不錯的。
好的熔解曲線和差的熔解曲線放在一起分析:
上圖中有一對復(fù)孔熔解曲線比較好,基本可以認(rèn)為是單峰;一對復(fù)孔熔解曲線出現(xiàn)了雙峰;其實仔細看,好的熔解曲線前面也有一個很小很小的峰,位置和不好的雙峰是相同的。那么可以認(rèn)為,差的熔解曲線也出現(xiàn)了特異性產(chǎn)物,雖然前面有一個非特異的峰。
好的熔解曲線和差的熔解曲線放在一起分析,轉(zhuǎn)過來看擴增曲線:
經(jīng)常要對應(yīng)二者來看的。
再看陰性對照的熔解曲線是正常的,未被污染。再來看熔解曲線:
基本上分成兩種;好的和不好的;而不好的與好的,在熔解曲線的峰上就分析而言,是吻合的;需要調(diào)整程序,降低非特異性擴增;具體表現(xiàn)在程序上,就是提高退火溫度,縮短延伸時間。
結(jié)論:基本得到目的產(chǎn)物,下一步工作是優(yōu)化反應(yīng)程序,提示:提高退火溫度,縮短延伸時間;
如果采用統(tǒng)一退火反應(yīng)條件,對于不好的引物,建議直接重新設(shè)計引物,合成,以便得到好的實驗結(jié)果。
原文地址:/biotech/exp/PCR/2011/h821102252.html
關(guān)鍵詞:擴增儀
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