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植物過氧化物酶同工酶測定

2011年04月26日 09:25:09人氣:1812來源:上海通蔚生物科技有限公司

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【資料簡介】

植物過氧化物酶同工酶測定

凡能催化同一種化學(xué)反應(yīng),但其分子結(jié)構(gòu)和帶電性質(zhì)不同的一組酶稱同工酶(isoenzyme)。同工酶譜的差異是基因表達的差異造成的,所以在研究植物基因調(diào)控與生長發(fā)育及其與環(huán)境條件的關(guān)系以及許多生理生化和遺傳問題時,常常要分析同工酶譜的差異。因此,同工酶研究在理論和實踐中都有非常重要的意義。

一、原理

聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合而成,具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié)。凝膠電泳兼有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。被分離物質(zhì)由于所載電荷數(shù)量、分子大小和形狀的差異,因此在電泳時產(chǎn)生不同的泳動速率而相互分離。利用特異性的顏色反應(yīng)使待測酶著色,這樣就可在凝膠中展現(xiàn)出酶譜。過氧化物酶是植物體內(nèi)常見的氧化酶。植物體內(nèi)許多生理代謝過程常與它的活性及其同工酶的種類有關(guān)。利用過氧化物酶能催化H2O2把聯(lián)苯胺氧化成藍色或棕褐色產(chǎn)物的原理,將經(jīng)過電泳后的凝膠置于有H2O2及聯(lián)苯胺的溶液染色,出現(xiàn)藍色或棕褐色部位即為過氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置,多條有色帶即構(gòu)成過氧化物酶同工酶譜。本實驗利用連續(xù)的盤狀凝膠電泳,采用Tris-Gly緩沖系統(tǒng)來分離陰離子過氧化物酶同工酶。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

(一)材料:小麥芽

(二)儀器設(shè)備: 1.穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀;2.冷凍離心機及離心管;3.成套電泳槽(圓盤型);4.pH試紙;5.其它常規(guī)用具。

(三)試劑: 1.分離膠緩沖液(pH8.9):1mol/L HCl48ml,Tris36.6g,TEMED0.23ml,加水定容至100ml。2.分離膠貯液:30g丙烯酰胺,0.8g甲叉雙丙烯酰胺,加水溶解并定容至100ml,過濾后使用。3.過硫酸銨溶液:過硫酸銨0.2g,加水定容至100ml制膠時現(xiàn)配現(xiàn)用)。4.濃縮膠緩沖液:1mol/L HCl48ml+Tris5.98g+TEMED0.46ml,調(diào)pH6.7,并定容至100ml。5.濃縮膠貯備液:丙烯酰胺10g,甲叉雙丙烯酰胺2.5g加水定容到100ml,使用前過濾。6.電極緩沖液:Tris 6.0g,Gly 28.8g,用水定容至1000ml(pH8.3),用前稀釋10倍。7.四甲基乙二胺(TEMED)。8.0.1%的溴酚藍水溶液。9.聯(lián)苯胺染色母液:聯(lián)苯胺1g+冰醋酸18ml+H2O2ml溶解貯于棕色瓶中。

三、實驗步驟

1.安裝電泳槽

2.凝膠的配制

3.過氧化物酶的提取 稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi),加入1mlH2O或0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH6,8)研成勻漿,轉(zhuǎn)入離心管,再用2ml前述溶液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管,3500rpm離心15~20min,其上清液即為酶的提取液,供電泳分析用。

4.點樣:用微量注射器吸取上清液,每管加樣50μl,再分別加入40%蔗糖溶液5μl,之后再用注射器將電極緩沖液慢慢加入每支膠管至浸沒頂部為止.zui后向上、下電泳槽倒入電極緩沖液(上槽必須淹沒管頂,下槽液要能浸泡著凝膠管),zui后在上槽液中滴入1~2滴溴酚藍溶液。

5.電泳:將電泳槽放至低溫處,在4℃左右,或接通電泳槽水冷卻系統(tǒng)按上“一”下“+”接好導(dǎo)線,通電,電泳開始電流應(yīng)低,每管1mA,10min后,再加大電流,使每管達到2~3mA,當溴酚藍指示劑達到距管底約1cm處時,切斷電流,停止電泳。

6.剝膠:電泳完畢,將電泳槽取出,倒去緩沖液,取下凝膠管,放入培養(yǎng)皿中。用一個帶有長針頭的注射器,吸滿水,將針頭沿管壁插入,同時慢慢地將注射器中的水推出,并不斷轉(zhuǎn)動凝膠管,將凝膠管擠脫出來,也可用洗耳球擠壓。

7.染色:取0.5ml聯(lián)苯胺母液+H2O 9.3ml+0.2ml3%H2O2,混勻后倒入盛有凝膠條的培養(yǎng)皿。此時可以看到膠條上出現(xiàn)藍色或棕褐色環(huán),即過氧化物酶帶,約十min后用自來水沖洗,這時藍色帶也慢慢變成棕褐色。

8.記錄酶譜,并計算各同工酶的遷移率
 

上海通蔚生物科技有限公司作者

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