溫度梯度凝膠電泳

【資料簡介】

在檢測點突變的電泳技術中，溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）是zui近出現的一種方法。zui先是將這種技術應用到DNA、RNA的分子構象分析、序列變異分析以及核酸、蛋白質的相互作用研究中，并將其逐漸發(fā)展為成熟的分子生物學技術。
一、TGGE分析原理
傳統的電泳分離方法基于分子的大小和帶電荷數的多少，TGGE則增加了一個新的分離參數，即分子構象。穩(wěn)定的構象由氫鍵和范德華力共同維系，并受環(huán)境溫度、鹽離于濃度、pH值等因素影響。如果環(huán)境溫度升高到某一限定點就可以破壞氫鍵和范德華力，這時分子即處于變性狀態(tài)，此過程就稱為熱變性。TGGE就是利用不同構象的分子具有不同的變性溫度（Tm）來進行分離釣。在正常情況下，DNA分子呈雙鏈結構狀態(tài)；當溫度升高到一定值時，DNA雙鏈開始解開，由完整的雙鏈變?yōu)榉植骐p鏈；如果溫度繼續(xù)升高，DNA雙鏈*解開，變?yōu)閱捂淒NA。這種分子構象的改變會影響分子在電泳時的遷移行為，因為DNA雙鏈的打開直接導致遷移率下降。這種影響在兩條鏈即將*解開時zui大，此時分子的電泳速度zui慢；而當全部形成單鏈時，泳動速度會變快。以一個雜合位點Aa來說，突變型aa與野生型AA相比只存在單堿基改變。在對雜合子個體Aa進行PCR擴增后，其PCR產物混合液中有4種組分：AA、aa、A（Waston鏈）a（Crick鏈）和a（Waston鏈）A（Crick鏈）4種不同構象的DNA雙鏈，它們的分子質量相同但Tm值各不相同。在進行TGGE時，異源雙鏈Aa和aA因存在不配對堿基而zui先變性，同源雙鏈AA和aa則因為堿基組成不同表現為不同的變性行為（GC堿基對有3個氫鍵，AT堿基對只有2個氫鍵）。這樣，4種Tm不同的雙鏈DNA的遷移率各不相同，zui后形成4條位置不同的泳帶。
二、TGGE實驗裝置和操作方法
TGGE分析是一種新的水平式PAGE電泳方法。根據TGGE溫度梯度方向與電泳方向是否一致可以進行兩種模式的TGGE：①垂直TGGE，其溫度梯度方向與電泳方向垂直，可用于優(yōu)化樣本的分離條件，也可用于分析PCR產物的組成。②平行TGGE，其溫度梯度方向與電泳方向一致，一般采用優(yōu)化后的電泳條件，可用于同時分析多個樣本。
目前市場上已有商品化的實驗裝置，如德國Biometra公司的產品TGGE sysrem。該系統包括3部分：電泳單元（溫度梯度板和電泳槽），微處理控制器（整合有電源功能）和常用附件（玻板、電極紙和膠聯膜）。溫度梯度板兩端的溫度設定值決定溫度梯度的線性范圍。控制器則可通過編程控制溫梯板的升溫時間、升溫速率及電泳溫度條件，并可將運行參數不間斷顯示出來。兩個可移動的緩沖液槽可以隨意放置，進行兩種電泳模式的安裝轉換。
TGGE的操作過程和常見的單鏈構象多態(tài)性（SSCP）有些相似，但更易于控制實驗條件，操作也更方便。基本操作步驟為：電泳系統安裝，溫度梯度編程，樣本制備，PAGE凝膠灌制及上樣，TGGE電泳及電泳后染色。與其他電泳方法一樣，PAGE凝膠的制備、剝離及上樣是TGGE分析中技巧性的操作，也是實驗成功的關鍵。該系統中關于灌膠的新穎設計使這一工作變得輕松易行。首先是玻板設計，可根據需要選擇不同齒突數的玻板，帶齒玻板在凝膠形成的同時也形成加樣孔，這樣避免了插入和拔出加樣梳的煩瑣操作。其次是膠聯膜的使用。一面疏水、另一面親水的膠聯膜可使膠液只在膠聯膜與帶齒突玻板間進行聚合，膠聯膜的支持作用還可保證凝膠在剝取時不會破爛。使用電極紙作為電橋連接凝膠與電泳緩沖液，簡化了凝膠安裝過程。
TGGE系統具有以下特點：①分辨率高，溫度梯度由微處理器控制，線性極為嚴格。2mm的距離zui大可對應0．6℃的溫度差，即使分子間的解鏈溫度（Tm）差異極細微也可以檢測出來。②加樣品量小，1～5mg的DNA或RNA上樣品量即可達到清晰的電泳分離效果。③重現性好，電泳條件（如溫度、時間等）易于控制，可以保證電泳的重現性和結果的重復性。④節(jié)約時間，小面積溫度梯度板和小尺寸凝膠（74cmX82cm），只需要2．5ml凝膠溶液。電泳可在30min至1h內完成。
三、TGGE技術的應用
TGGE技術的zui大特點是具有高分辨能力，能夠100％檢出只存在單堿基差異的突變個體。該方法還具電泳條件易于控制、重現性好、操作簡便快速等優(yōu)點，所以這種方法出現以后很快就得到廣泛的應用，包括用分子生物學技術進行研究的腫瘤學、病毒學、免疫學、群體分析和RNA研究等領域。
對人類疾病基因的突變，或者轉基因動物突變個體的檢測，或者對某些未知基因突變的篩選，都需要這種檢測或篩選方法能夠檢出所有可能發(fā)生的突變情況。為此，Riesner等設計了一種特別的PCR—TGGE方法。與野生型相比，突變型因為堿基序列發(fā)生改變，導致TGGE電泳條帶的位置改變，并且條帶位置因突變位置的不同而不同。這種條帶位置的改變可根據熱動力學統計方程計算出來，從而確定突變發(fā)生的位置。如果要確定標本中某特異DNA或RNA序列的數量，則可采用定量PCR-TGGE方法。針對靶序列設計的內參照序列與靶基因之間只存在特定位點的單堿基改變，將已知拷貝數的內參照與標本中的靶基因共同擴增。TGGE分離兩者的擴增產物，根據兩者的擴增比率就可以確定標本中靶基因的拷貝數。
在人類遺傳病和腫瘤基因研究中，PCR—TGGE也得到廣泛應用。Horn采用TGGE方法對I型神經纖維瘤（NFl）患者進行普查，發(fā)現了NFl基因的3個新突變。隨著對各種遺傳病和腫瘤分子病理學研究的深入，人們發(fā)現的遺傳病和腫瘤相關基因日益增多，TGGE技術將會得到更多的應用。另外，TGGE方法也可用于蛋白質的分子結構和熱穩(wěn)定性研究，以及溫度敏感蛋白質（如酶類）的分離與鑒定分析。