細胞計數(shù)及活力測定方法

【資料簡介】

 

一、原理
培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好,所以要進行細胞計數(shù).計數(shù)結果以每毫升細胞數(shù)表示.細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同.
在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞,總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力,由組織中分離細胞一般也要檢查活力,以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用.復蘇后的細胞也要檢查活力,了解凍存和復蘇的效果.
用臺盼蘭染細胞,死細胞著色,活細胞不著色,從而可以區(qū)分死細胞與活細胞.利用細胞內某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應,也可測定細胞相對數(shù)和相對活力.
二、儀器、用品與試劑
1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數(shù)板、試管、吸管、酶標儀（或分光光度計）
2、試劑：0.4％臺盼蘭,0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇
3、材料：細胞懸液
三、操作步驟
（一）細胞計數(shù)
1、將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈,并將蓋片蓋在計數(shù)板上.
2、將細胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間.
3、靜置3分鐘.
4、鏡下觀察,計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù),壓線細胞只計左側和上方的.然后按下式計算：
細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團,應按單個細胞計算,若細胞團占10%以上,說明分散不好,需重新制備細胞懸液.
（二）細胞活力
1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中.
2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液,染色2一3分鐘.
3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片.
4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù),計細胞活力.
死細胞能被臺盼蘭染上色,鏡下可見深蘭色的細胞,活細胞不被染色,鏡下呈無色透明狀.
活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行,但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用.
（三）MTT法測細胞相對數(shù)和相對活力
活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍.其量與細胞數(shù)呈正比,也與細胞活力呈正比.
l、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘,棄上清液.
2、沉淀加入0.5－1ml MTT,吹打成懸液.
3、37℃下保溫2小時.
4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）.打勻.
5、1000 rpm離心,取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色,酸化異丙醇調零點.
注意：MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力,不能測定細胞數(shù).
附：1、0.4%臺盼蘭染液配制：
臺盼蘭 0.4克加雙蒸水至100 ml.
2、MTT配制：
MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎液中.4℃下保存.
3、酸化異丙醇配制：
異丙醇中加入HCl使zui終達0.04mol/L.