ELISPOT技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)

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 ELISPOT全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來（Sedgwick JD 2005）。

該技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子具有三大優(yōu)點(diǎn)：其一，靈敏度高。在一百萬個(gè)陰性細(xì)胞中只要有一個(gè)分泌細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞即可被檢測(cè)出來。這是目前為止，zui為靈敏的檢測(cè)技術(shù)，靈敏度比傳統(tǒng)的的ELISA方法高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。其二，單細(xì)胞水平，活細(xì)胞功能檢測(cè)。ELISPOT檢測(cè)的是單個(gè)細(xì)胞分泌，而非細(xì)胞群體的平均分泌。在檢測(cè)的過程中，有活細(xì)胞培養(yǎng)與抗原刺激階段，檢測(cè)的是活細(xì)胞的功能，而非死細(xì)胞的物。其三，操作簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，可以進(jìn)行高筒量篩選。ELISPOT沒有復(fù)雜的細(xì)胞體外擴(kuò)增過程，不使用同位素，不需要大型的、專門的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備。按照標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作，一個(gè)實(shí)驗(yàn)者可以同時(shí)處理數(shù)百個(gè)樣品，效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它檢測(cè)方法（Kalyuzhny AE 2005）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行，直接以培養(yǎng)板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纖維素膜為基質(zhì)，包被上特異性的單克隆抗體，用以捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。（由于涉及到細(xì)胞培養(yǎng)的過程，對(duì)單克隆抗體的要求要遠(yuǎn)高于ELISA中的捕獲抗體，該抗體需要無毒，不含內(nèi)毒素，親和力高等特點(diǎn)。）之后，在培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)基（現(xiàn)在無血清ELISPOT技術(shù)已經(jīng)成熟，培養(yǎng)基中可以不再含有血清）、待檢測(cè)的細(xì)胞以及抗原刺激物進(jìn)行培養(yǎng)。

在特異性的抗原或者非特異性的有絲分裂原的刺激下，數(shù)小時(shí)之內(nèi)，T細(xì)胞就會(huì)開始分泌各種細(xì)胞因子。細(xì)胞因子當(dāng)即就被位于細(xì)胞下方的膜上的單克隆抗體所捕獲。在洗去細(xì)胞之后，被捕獲的細(xì)胞因子可以與*標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，然后用酶標(biāo)親和素再與*結(jié)合，進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色，就可以在膜的局部形成一個(gè)個(gè)圓形的斑點(diǎn)。每一個(gè)斑點(diǎn)就對(duì)應(yīng)了當(dāng)初一個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞，這些細(xì)胞被稱為斑點(diǎn)形成細(xì)胞（Spots forming cells SFCs）。統(tǒng)計(jì)膜上的斑點(diǎn)的數(shù)目，再除以當(dāng)初加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，就可以計(jì)算出陽性細(xì)胞的頻率。