豬*酶活力的測定

【資料簡介】

實驗原理

* 是以無活性的酶原形式存在于動物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶 或有活性的* 自身激活，從肽鏈N端賴氨酸和異*殘基之間的肽鍵斷開，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?。

*原的分子量約為24000，其等電點(diǎn)約為pH8.9，*的分子量與其酶原接近（23300），其等電點(diǎn)約為pH10.8，zui適pH7.6～8.0，在pH=3時zui穩(wěn)定，低于此pH時，*易變性，在pH>5時易自溶。Ca2+離子對*有穩(wěn)定作用。

重金屬離子，有機(jī)磷化合物和反應(yīng)物都能抑制*的活性，胰臟、卵清和豆類植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑 。zui近發(fā)現(xiàn)在一些植物的塊基（如土豆、白薯、芋頭等）中也存在有*抑制劑 。

*能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基酸 （*、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸 的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸一端的選擇。*對這些鍵的敏感性次序為：酯鍵> 酰胺鍵> 肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來測定*的活力。目前常用苯甲酰-L-*-對硝基苯胺（簡稱BAPA）和苯甲酰-L-*-β-萘酰胺（簡稱BANA）測定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-*乙酯（簡稱BAEE）和對甲苯磺酰-L-*甲酯（簡稱TAME）測定酯酶 活力。本實驗以BAEE為底物，用紫外吸收法測定*活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測定方法而異。

從動物胰臟中提取*時，一般是用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來，然后再根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級鹽析將*原等（包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級鹽析將*原等（包括大量*原和彈性蛋白酶原）沉淀析出。經(jīng)溶解后，以極少量活性*激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?（*和彈性蛋白酶同時也被激活），被激活的酶溶液再以鹽析分級的方法除去*及彈性蛋白酶等組分。收集含*的級分，并用結(jié)晶法進(jìn)一步分離純化。一般經(jīng)過2～3次結(jié)晶后，可獲得相當(dāng)純的*，其比活力可達(dá)到8000～10000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。

如需制備更純的制劑，可用上述酶溶液通過親和層析方法純化。

試劑和器材

一、試劑

pH2.5乙酸酸化水；2.5mol/L H2SO4；5 mol/L NaOH；2 mol/L NaOH；2mol/L HCl；0.001M

HCl；硫酸銨；氯化鈣。

0.8 mol/L pH9.0硼酸緩沖液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計檢查校正。

0.4 mol/L pH9.0硼酸緩沖液（用0.8 mol/L稀釋1倍即可）；

0.2 mol/L pH8.0硼酸緩沖液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計校正。

0.05 mol/L pH8.0 Tris －HCl 緩沖液：取50mL 0.1 mol/LTris 加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。

底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 緩沖液中加0.34毫克BAEE和2.22毫克的氯化鈣。

二、材料

新鮮或冰凍豬胰臟

三、儀器

食品加工機(jī)和高速分散器；研缽 ；大玻璃漏斗 ；布氏漏斗 ；抽濾瓶；紗布；恒溫水浴 ；紫外分光光度計 ；秒表；pH試紙 。

操作方法

一、豬*制備

（一）豬*原的提取

豬胰臟1.0Kg（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結(jié)締組織后，絞碎。
加入2倍體積預(yù)冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃攪拌提取24小時，四層紗
布過濾得乳白色濾液，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，放置3～4小時后用折迭濾紙 過濾得黃色透明濾液（約1.5升）。

加入固體硫酸銨（予先研細(xì)），使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492克）放置過
夜后抽濾（擠壓干），得豬*原粗制品。