酶免疫電鏡技術(shù)

【資料簡(jiǎn)介】

酶免疫電鏡技術(shù)
 

（一）  原理 
酶免疫電鏡技術(shù)是利用酶的率的催化作用對(duì)其底物的反應(yīng)形成不同的電子密度，借助于電子顯微鏡觀察，證明酶的存在，從而對(duì)抗原進(jìn)行定位。
（二）材料與試劑
1．PBS液  取NaCl 8.5g，Na2HPO40.85g，KH2PO40.54g，加水至1 000ml即可。
2．DAB溶液  取5mgDAB（3、3二氨基聯(lián)苯胺）加入10mlTris－HCl緩沖液（0.05mMol/L pH 7.6），加1%H2O20.5ml～1ml。配制時(shí)，避光進(jìn)行，現(xiàn)用現(xiàn)配。在顯色完成沖洗過程中，要保持流水沖洗，防止非特異性物質(zhì)積于標(biāo)本上。
3．戊二醛固定液  取50ml 0.2Mol/L PBS緩沖液與25%戊二醛按以下比例配制：
0.2Mol/LPBS液         50     50    50    50    50
25%戊二醛（ml）        4     6     8     10    12
重蒸餾水（ml）         46    44    42    40     28
固定液終濃度（%）     1.0    1.5   2.0    2.5    3.0
（三）操作方法
1．酶標(biāo)抗體的制備  疫酶技術(shù)章。
2．取材 將培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞用0.1Mol/L PBS液沖洗，離心沉淀后，立即轉(zhuǎn)入固定液（2%甲醛液或2%戊二醛液均可）pH 7.2，4℃固定5min～30min（依抗原性質(zhì)所定）。如病料為組織塊，則取適當(dāng)大小，先固定1h然后取出，以新的雙面刀片切成50～100μm的薄組織再行固定1h～2h。
3．漂洗  以PBS液漂洗過夜，換液3～4次。
4．血清孵育，25℃1h或4℃過夜，孵育的標(biāo)本放置于加蓋的瓷盤內(nèi)，底層墊數(shù)層紗布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脫，造成非特異性吸附。
5．PBS沖洗3～4次，每次10min。
6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。
7．PBS液沖洗3～4次每次10min。
8．酶標(biāo)記抗體孵育；用適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體（即工作濃度）于25℃濕盆內(nèi)孵育1h或4℃過夜。
9．PBS液沖洗3～4次每次10min或4℃漂洗過夜。
10．酶顯色處理  將漂洗后的標(biāo)本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。顯色強(qiáng)弱與戊二醛的固定有關(guān)。若顯色弱則可減少甚至取消戊二醛的固定時(shí)間。沖洗時(shí)必須注意防止非特異漂浮的沉積。
11．常規(guī)包埋、切片、電鏡觀察  在經(jīng)過脫水包埋確定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色，切片一般在2μm～4μm，切片后染色不存在通透困難的問題。無論在標(biāo)記染色后切片還是在切片后標(biāo)記染色，在光鏡下定位選擇后，再做電鏡定位包埋，這樣目的性強(qiáng)，可減少工作量。
（四）結(jié)果判定
在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，凡出現(xiàn)棕色顆粒，即指示抗原抗體的存在，同時(shí)可觀察到病毒顆粒的存在，判為陽性（＋），否則判為陰性（－）。