心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

【資料簡介】

用Langendorff灌流消化（膠原酶II）只能取得心肌細(xì)胞。建議直接將心臟剪碎，成纖維細(xì)胞我們這里一般采用0.05％消化。無菌條件取出心臟D-hank's液（PBS也可）漂洗，剪碎心臟加入5倍體積消化液，37C水浴3－5min，反復(fù)吹打，靜置，待自然沉降后棄去上清液。剩余沉淀再加入約5倍體積0.08%及0.1%膠原酶II混合液，反復(fù)吹打，大約10分鐘（消化時間往往靠經(jīng)驗的判斷），離心取沉淀重懸于含20％BSA的DMEM（有條件可以用Cascade的培養(yǎng)液）。60－90min后更換培養(yǎng)液（差速貼壁，成纖維細(xì)胞比心肌細(xì)胞貼壁快）。

1、的作用比較強(qiáng)烈，聯(lián)合使用膠原酶將膠原纖維充分消化后利于離心時細(xì)胞沉淀，提高細(xì)胞存活率。另外，消化時間不宜太長，主要憑觀察和經(jīng)驗來判斷。離心采用1000rpm 5min。

2、酶的配置可以用d-Hank's液或生理鹽水都行。血清的作用主要是終止消化，用一般加了血清的DMEM就行，我們這里是20％胎牛血清。

3、貼壁時間：我?guī)熜衷?jīng)告訴我2hr，現(xiàn)在我覺得90min已經(jīng)很好了。

4、細(xì)胞可以先用臺盼藍(lán)測定存活率。

5、鑒定：在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核大，呈橢圓形，常含有2－3 個核。IHC可以用I抗體（動物抗人B3、抗波形蛋白、抗血管平滑肌肌動蛋白）其余基本按IHC的步驟來