人胰高血糖素樣肽（GLP-）ELISA試劑盒原理

【資料簡介】

人胰高血糖素樣肽（GLP-）ELISA試劑盒原理

用 途：
人胰高血糖素樣肽GLP-用于體外定量檢測血清、血漿、組織、緩沖液中細胞上清液及各種體液中的GLP- 。本試劑盒可以檢測天然和重組的GLP- 。本試劑盒于科研、而非用于臨床診斷。

試驗原理：
人GLP-試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知GLP- 濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將GLP- 和標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中GLP- 的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制
人胰高血糖素樣肽GLP-試劑盒成份（2-8℃保存）    96孔配置    48孔配置    配制
96/48人份酶標板    塊板（96T）    半塊板（48T）    即用型
塑料膜板蓋    塊    半塊    即用型
標準品：240pmol/L    瓶（0.6ml）    瓶（0.3ml）    按說明書進行稀稀
空白對照    瓶（.0ml）    瓶（0.5ml）    即用型
標準品稀釋緩沖液    瓶（5ml）    瓶（2.5ml）    即用型
標記的抗GLP-抗體    瓶（6ml）    瓶（3.0ml）    即用型
親和鏈酶素-HRP    瓶（0ml）    瓶（5.0ml）    即用型
洗滌緩沖液    瓶（60ml）    瓶（30ml）    按說明書進行稀釋
底物A    瓶（6.0ml）    瓶（3.0ml）    即用型
底物B    瓶（6.0ml）    瓶（3.0ml）    即用型
終止液    瓶（6.0ml）    瓶（3.0ml）    即用型

自備材料
．蒸餾水。
2．加樣器：5ul、0 ul、50 ul、00 ul、200、500 u、000lul。
3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
．此人胰高血糖素樣肽GLP-試劑盒的人血制品中的HbsAg、和抗HIV為陰性，但沒有實驗室可*保證此血制品不會傳染肝炎、AIDS或其它傳染病，依據(jù)當?shù)氐陌踩珬l例處理本試劑盒里的成份及血清和血漿等樣品。
2．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
3．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
4．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項
．試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。
2．實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6．洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。
7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8．加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9．按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
、血清-----人胰高血糖素樣肽GLP-操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，000×g離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、細胞上清液---000×g離心0分鐘去除顆粒和聚合物。
4、保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
．標準品：標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
240 pmol/L    （6號標準品）    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
20 pmol/L    （5號標準品）    00ul的原倍標準品加入00ul的標準品稀釋液
60 pmol/L    （4號標準品）    00ul的5號標準品加入00ul的標準品稀釋液
30 pmol/L    （3號標準品）    00ul的4號標準品加入00ul的標準品稀釋液
5 pmol/L    （2號標準品）    00ul的3號標準品加入00ul的標準品稀釋液
7.5 pmol/L    （號標準品）    00ul的2號標準品加入00ul的標準品稀釋液
0 pmol/L    （空白對照）    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩沖液（20×）的稀釋：蒸餾水20倍稀釋。

操作步驟
．人胰高血糖素樣肽GLP-使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育小時。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作四次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作四次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果分析
以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的GLP- 標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的GLP- 含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

局限
6號標準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到的結(jié)果。

人胰高血糖素樣肽GLP-試劑盒性能
．靈敏度：zui小的檢測濃度小于號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2．特異性：不與人其它細胞因子反應(yīng)。
3．重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于0%。