磷酸鈣介導(dǎo)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗

【資料簡介】

實驗材料    真核細(xì)胞
試劑、試劑盒    CaCl2HEPES緩沖化銫PBS
儀器、耗材    培養(yǎng)箱錐形管離心管
實驗步驟    
1.  在轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分入10 cm 組織培養(yǎng)平板中。當(dāng)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，倍增時間為18~24 h時，一般按1：15從長滿的培養(yǎng)皿中分細(xì)胞效果較好，轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，細(xì)胞應(yīng)在培養(yǎng)皿中很好地分散分布。在加入沉淀前2~4 h，用9 ml *培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。
 
2.  將要轉(zhuǎn)染的DNA用乙醇沉淀，空氣中晾干沉淀。將DNA沉淀重懸于450 μl 無菌水中，加50 μl 2.5 mol/l CaCl2。
 
3.  加500 μl 2×HeBS于一無菌的15 ml 錐形管中，將機(jī)械式移液器安上1 ml 吸頭， 一邊吹打2XHeBS，一邊用巴斯德吸管逐滴加入DNA/CaCl2溶液，隨即在漩渦混合器上振蕩5 s，將其在室溫下靜置20 min 以形成沉淀。

4.  將沉淀均勻加入10 cm 平板的細(xì)胞中，輕輕晃動。
 
5.  在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下培養(yǎng)細(xì)胞4~16 h，除去培養(yǎng)液，用5 ml 1×PBS洗細(xì)胞2次，加 10 ml *培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。

6.  對于短暫分析實驗，可在既定的時刻收集細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，讓細(xì)胞生長兩個倍增時間后分入培養(yǎng)皿中進(jìn)行選擇培養(yǎng)。
實驗材料    真核細(xì)胞
試劑、試劑盒    *培養(yǎng)液TEBES
儀器、耗材    培養(yǎng)箱平板
實驗步驟    
1.  轉(zhuǎn)染前一天接種呈指數(shù)生長的細(xì)胞，密度為5×105/10 cm  平板。加10 ml *培養(yǎng)液，在開始轉(zhuǎn)染時細(xì)胞數(shù)應(yīng)＜106/平板，以留足夠供細(xì)胞擴(kuò)增至少2倍的表面積。

2.  用TE緩沖液稀釋質(zhì)粒DNA至1 μg/μl ，4 ℃保存。
 
3.  將zui適量的質(zhì)粒DNA與500 μl 0.25 mol/l CaCl2混合，加入500 μl 2×BBS中，混勻，室溫下溫育10~20 min。

4.  將磷酸鈣-DNA溶液逐滴加入培養(yǎng)皿的細(xì)胞中，同時晃動培養(yǎng)皿，在35℃ 3%CO2培養(yǎng)箱中溫育15~24min。
 
5.  用5 ml PBS洗細(xì)胞兩次，加入10 ml *培養(yǎng)液。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，在35~37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對于短暫表達(dá)，培養(yǎng)細(xì)胞48~72 h。
 
6.  在開始選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)抱前按1：10至1：30分傳細(xì)胞。于35~37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 
7.  將培養(yǎng)液換成選擇培養(yǎng)液，或在適當(dāng)?shù)倪x擇條件下培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。