在大腸桿菌（E.Coli）表達蛋白產(chǎn)物

【資料簡介】

一、原理
1、 E . coli 表達系統(tǒng)
E . coli 是重要的原核表達體系。在重組基因轉化入E . coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導其在宿主菌內表達目的蛋白質，將表達樣品進行SDS-Page 以檢測表達蛋白質。
2、 外源基因的誘導表達
提高外源基因表達 水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段，以減輕宿主菌的負荷。常用的有溫度誘導和藥物誘導。本實驗采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導外源基因表達。
不同的表達質粒 表達方法并不*相同，因啟動子不同，誘導表達要根據(jù)具體情況而定。

二、材料
1、誘導表達材料
( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培養(yǎng)基
酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%
蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
適用范圍：大腸桿菌
( 2 ) IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，－20 ℃ 保存。
( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液：
50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS （電泳級）
0.1 ％ 溴酚藍
10 ％ 甘油
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料
1 ）酶溶法
（1）裂解緩沖液：
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / L NaCI
（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL *。
（4）脫氧膽酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超聲破碎法
( 1 ) TE 緩沖液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 % SDS
0.2 ％ 溴酚藍
20 ％ 甘油
三、實驗方案
1、外源基因的誘導表達
( 1 ）用適當?shù)南拗菩詢惹泻怂崦赶d體DNA 和目的基因。
( 2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉化到相應的宿主菌。
( 3 ）篩選出含重組子的轉化菌落，提取質粒DNA 作限制性內切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，
確定無誤后進行下一步。
( 4 ）如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時，使培養(yǎng)液的OD600達0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ；如果表達載體的原核啟動子為tac 等，則37 ℃培養(yǎng)細菌數(shù)小時達到對數(shù)生*后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h 。
( 5 ）取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化
1 ）細菌的裂解
常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應用，后三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。