線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒紫外檢測(cè)法

【資料簡(jiǎn)介】

線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒紫外檢測(cè)法正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定 
測(cè)定意義： 
線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素 C 氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成
分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素 C的氧化，并zui終把電子傳遞給氧，生成水。 
測(cè)定原理： 
還原型細(xì)胞色素 C在 550nm有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素 C生成氧
化型細(xì)胞色素 C，因此 550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。 
需自備的儀器和用品： 
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。 
線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒紫外檢測(cè)法試劑的組成和配制 
試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑二：  5mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑四：液體10mL×2 瓶，4℃保存； 
試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存； 
試劑六：粉劑×2 支，-20℃保存； 
樣本的前處理： 
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離： 
1、 準(zhǔn)確稱取 0.1g組織或收集 500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一和 10uL 試劑三，用冰
浴勻漿器或研缽勻漿。 
2、 將勻漿 600g，4℃離心5min。 
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。 
4、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選
做） 。 
5、 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 200uL試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，
功率 20％或200W，超聲 3s，間隔 10秒，重復(fù)30 次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定。 
測(cè)定步驟： 
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm，蒸餾水調(diào)零。 
2、 樣本測(cè)定 
（1）工作液的配制：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)
移到試劑四中混合溶解。分批配制工作液是為了防止當(dāng)天不能測(cè)完，導(dǎo)致工作液失效。 
（2）將工作液置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑 4℃
可保存一周； 
（3）在 1mL玻璃比色皿中加入40μL樣本和 800μL工作液，立即混勻，記錄 550nm處初
始吸光值 A1和  1min后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。 
注意點(diǎn)： 若 ΔA大于 0.2， 需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù) （計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)） ，
使 A1-A2小于 0.2，可提高檢測(cè)靈敏度。  
復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算： 
（1）  按樣本蛋白濃度計(jì)算 
單位的定義：每 mg組織蛋白每分鐘催化降解 1 nmol  還原型細(xì)胞色素 C定義為一個(gè)酶活力
單位。 
  復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷(V樣×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr 
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。 
（2）  按樣本鮮重計(jì)算 
單位的定義：每 g組織每分鐘催化降解1nmol  還原型細(xì)胞色素 C定義為一個(gè)酶活力單位。 
  復(fù) 合 體 Ⅳ 活力 (nmol/min/g  鮮 重 )=[ΔA×V 反 總÷（ ε×d） ×109
]÷(W×  V 樣 ÷V 樣
總)÷T=222×ΔA÷W 
（3）  按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 
線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒紫外檢測(cè)法單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個(gè)酶
活力單位。 
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104
 cell)=[ΔA×V反總÷ （ε×d） ×109
]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.444×ΔA 
V反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10-4
 L；ε：細(xì)胞色素 C摩爾消光系數(shù)，1.91×104
 L / mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，1  min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)
菌總數(shù)，500萬(wàn)。 
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