腹瀉性貝類毒素（DSP）ELISA檢測試劑盒

【資料簡介】

腹瀉性貝類毒素(DSP)ELISA檢測試劑盒使用說明書貨號：PN520021美國Abraxis*，齊一生物美國Abraxis*代理，更多進口原裝農(nóng)殘試劑盒。 （中文說明書僅供參考，應以英文說明書為準）

1.概述

腹瀉性貝類毒素檢測試劑盒的原理是酶聯(lián)免疫吸附測定法，用于水及水產(chǎn)品中腹瀉性貝類毒素的定量測定。岡田酸是腹瀉性貝類毒素的一種。對于水產(chǎn)品需要做前處理，不可以直接檢測。如果需要的話陽性樣品可以通過HPLC和GC/MS來驗證。

2.安全性說明書

試劑盒中的標準溶液里含有少量的岡田酸。底物中包含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液中含有稀硫酸。要避免

皮膚和粘膜與終止液接觸，如果不小心接觸了請馬上用水沖洗。

腹瀉性貝類毒素(DSP)ELISA檢測試劑盒3．保存和穩(wěn)定性

試劑盒應保存在2-8℃，不要冷凍。在使用之前要把試劑盒中的溶液回復到室溫（20-25℃）。有效期內(nèi)試劑盒中的試劑都可以使用。

4．原理

試劑盒的原理是直接競爭ELISA法，通過特異性抗體來識別岡田酸。當樣品中含有岡田酸時，樣品中的岡田酸與岡田酸酶結(jié)合物競爭結(jié)合溶液中的岡田酸抗體。岡田酸抗體與包被在微孔板上的羊抗鼠二抗結(jié)合。經(jīng)過一步洗滌加入底物溶液，產(chǎn)生有色反應。產(chǎn)生的綠色的顏色深度與樣品中岡田酸的含量成反比。加入反應停止液后使顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。用酶標儀在450nm處測定吸光度值。通過繪制標準曲線來計算樣品中岡田酸的含量。

5. 岡田酸試劑盒的局限性和可能的干擾

對在水樣中經(jīng)常出現(xiàn)的多種有機物和無機物已近作過檢測對此試劑盒并無干擾。由于化合物的易變質(zhì)性由基質(zhì)反應引起的干擾是不可能*避免的。操作不當也可能導致檢測結(jié)果錯誤，比如：試劑盒保存條件不對、錯誤的加液順序、試劑的量沒有加準確、孵育的時間太長或太短、孵育的溫度太高或太低。與其它檢測方法一樣對陽性結(jié)果要求通過其它傳統(tǒng)的方法來驗證。

6．岡田酸測定的重要性

岡田酸是腹瀉性貝類毒素的一種，受岡田酸污染的貝類和有害藻類大量繁殖的有關。DSP可以引起劑量依賴型的腹瀉、惡心、嘔吐癥狀。FDA對ASP的*是0.2ppm。歐洲是160ug。這個試劑盒可以檢測40個樣品（做兩個重復）。需要少量的樣品，檢測時間少于2小時。

腹瀉性貝類毒素(DSP)ELISA檢測試劑盒7．試劑盒特性

敏感性：0.1ng/ml

重復性：標準的變異系數(shù)小于10%，樣品的變異系數(shù)小于15%

特異性：

腹瀉性貝類毒素檢測試劑盒能檢測Okadaic acid及其它DSP，它們的結(jié)合程度是不同，以下表格中展示的是相關值及交叉反映率（%CR），以下所有濃度均為ppb級。

種 類	% CR	種 類	% CR
Okadaic Acid (DTX)	99%	Dinophysistoxins DTX-2	50%
Dinophysistoxins DTX-1	50%

 

 

樣品：水樣和貝類產(chǎn)品

標準曲線：

A．試劑盒組成：

1、包被二抗的微孔板（羊抗兔）

2、標準（7種）0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、ng/ml

3、岡田酸抗體溶液（兔抗岡田酸）6ml

4、岡田酸酶標記物6ml 

5、樣品稀釋液（10倍濃縮）25ml，用于稀釋樣品

6、5x 濃縮洗液100ml

7、顯色液（底物）TMB,16ml

8、終止液12ml

B 測試前準備

微量移液器和吸頭是必須使用的，使用排槍加液這樣可以確保整個微孔板上的孔在每個步驟的反應時間趨于一致。在做同一次測試時要使用同一個盒子里的試劑和標準。在操作前仔細閱讀說明書。

1、使用前將所有的試劑拿到室溫（19℃-25℃）。

2、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。置于4-8℃保存。

3、標準液，對照，酶結(jié)合物，底物，終止液不用稀釋直接使用。

4、洗液在使用前要以1：5的比例稀釋后使用（100 mL 5X 洗液加 400 mL 無離子水）

5、由于終止液中含稀硫酸拿的時候要小心。

C.操作步驟

1、在對應的微孔中加入100μL的標準和樣品（做2-3個重復）

2、每個測試孔都加入50 μL岡田酸酶標記物溶液。

3、每個測試孔都加入50 μL岡田酸抗體溶液，用封口膜把微孔板蓋上，輕輕的震蕩微孔板30秒使里面的液體混勻。不要使液體灑出。

4、在室溫下孵育60分鐘。

5、孵育完成后，把封口膜取掉，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1 X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL1 X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。

6、每個測試孔加入150μL的顯色液（底物）。室溫孵育20-30分鐘，此步驟避免太陽光照射。

7、每個測試孔加入100μL終止液。

8、用酶標儀在450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD）（在加入終止液15分鐘內(nèi)完成）。

D 結(jié)果分析

結(jié)果分析可以利用商業(yè)ELISA分析軟件(4-parameters,Logit/Log)。手工計算可以先計算標準的吸光度值的平均值，然后計算每個標準的%B/B0（用其它標準的吸光度值除以零標準的吸光度值乘以99%）。以每個標準的%B/B0做Y軸，以每個標準的岡田酸的濃度做X軸構(gòu)建標準曲線。通過利用標準曲線，把樣品的%B/B0代入標準可以計算出樣品中岡田酸的濃度。樣品中岡田酸的含量小于0.1 ppb認為陰性。當樣品中岡田酸的含量大于5.0 ppb要稀釋后再測定。

E 劑盒未提供的材料

1、10-200ul和200-1000ul的移液器及吸頭.

2、10-250ul多道移液器及吸頭。

3、酶標板洗板儀（可選）

4、450nm的酶標儀。 

5、酶標板震蕩儀（可選）

 

F. 工作計劃

微孔板由12條構(gòu)成，每條8孔。在測試中可以單獨使用。每次檢測都必須做標準。

Std0-Sd6: 標準 0；0.1；0.2；0.5；1.0；2.0；5.0ppb

Sam1, Sam2， etc.: Samples

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Std0

Std4

etc

B

Std0

Std4

etc

C

Std1

Std5

D

Std1

Std5

E

Std2

Std6

F

Std2

Std6

G

Std3

Sam1

H

Std3

Sam1

G.樣品制備

肌肉樣品:樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存

1. 除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)。

2. 稱取1g 均質(zhì)后的樣品加入6ml 80%的甲醇(甲醇80：蒸餾水20)

3. 離心：3500g離心10分鐘，收集上清液。

4.  加2ml80%的甲醇(甲醇80：蒸餾水20)到上步驟中的殘留貝肉組織中再離心：4℃下，3500g離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟3收集的上清液中。

5.  重復步驟4待收集的上清液達到10ml時，用0.45um的濾膜過濾。

6.  取100ul濾液，用樣品稀釋緩沖液稀釋到1ml(10倍稀釋)

7.  取100ul用試劑盒進行分析，此時的稀釋倍數(shù)是100。

注意：如樣品中含量低可以將稀釋倍數(shù)降低，例如25倍。如樣品含量很高可以將稀釋倍數(shù)加大，如1000倍。只需要在第6部稀釋過程改變就可以。

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