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海洋大學(xué)大鼠ELISA實驗報告
2013-10-18 閱讀(1575)
海洋大學(xué)大鼠ELISA實驗報告
實驗名稱：
酶聯(lián)免疫吸附劑測定
實驗原理：
酶聯(lián)免疫吸附測定是一種免疫測定技術(shù)。測定中，先使抗原吸附在固相載體上，然后加待測的抗體，再用某種酶標(biāo)記抗體，形成抗原-抗體-酶標(biāo)記抗體的“雙抗體夾心”，此時酶仍保有活性，同時標(biāo)記抗體亦有免疫活性。之后再加入酶的底物，在酶的催化下產(chǎn)生反應(yīng)并產(chǎn)生有色物，顏色深淺與待測物質(zhì)的量直接相關(guān)。至此，酶的催化放大作用與免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合，提高了測定的準(zhǔn)確性與靈敏度。
實驗材料與試劑：
1．聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板（平板, 96孔）。
2．酶聯(lián)免疫檢測儀。
3．辣根過氧化物酶羊抗兔IgG。
4．包被液：0.05 mol/L 碳酸緩沖液（pH 9.6）： Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g， 蒸餾水稀釋至100 ml。
5．稀釋液（PBS-Tween）： NaCl 8g, KCl 0.2g， KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20，0.5ml，蒸餾水加至1000ml。
6．洗滌液：同稀釋液。
7．封閉液：0.5 % （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）BSA（用PBS配制）。
8．鄰苯二胺溶液（底物）： 配制： 0.1 mol/L 檸檬酸 （2.1g/100ml）, 取6.1ml， 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O （7.163g/100ml）, 取6.4ml, 加蒸餾水12.5ml, 取鄰苯二胺8mg（溶解）； 臨用前加30 % （體積分?jǐn)?shù)）H2O2 40μl。
9．終止液：2 mol/L H2SO4。
實驗步驟：
1．包被抗原： 用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋, 一般為1~10μg/孔，每孔加200μl, 37 ℃溫育30min。
2．洗滌：倒盡板孔中液體，加200μl洗滌液，反復(fù)三次，zui后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。
3．加封閉液200μl，37 ℃溫育30min。
4．洗滌同2。
5．加被檢血清： 用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋，每孔200μl。同時作稀釋液對照。37 ℃溫育30min。
6．洗滌同2。
7．加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200μl, 37 ℃溫育30min。
8．洗滌同2。
9．加底物：鄰苯二胺溶液加200μl，室溫暗處5min。
10．加終止液：每孔50μl。
11．觀察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄OD490nm讀數(shù)。
實驗結(jié)果：
數(shù)據(jù)如下：
實驗討論：
1．無一抗（10）數(shù)據(jù)值存在異常。理論上應(yīng)趨近于零?？赡苁怯捎谑芪廴舅?，實驗現(xiàn)象比較清晰，隨濃度由濃到稀，顏色由深黃漸變?yōu)闇\黃。
2．線性關(guān)系比較明顯。但斜率隨濃度減小而有所增大。這可能是在使用取液器時有氣泡混入，導(dǎo)致實際濃度低于理論上的濃度。
3．組號（2）（4）（5）中3個樣本數(shù)據(jù)差別較大，可能是因為配血清時混合不夠均勻所致。
這個實驗采用了間接法測定，利用酶的催化放大作用提高了檢測的靈敏度。作為一名精儀系的學(xué)生，這給予我的啟示就是，在直接測量精度如果遇到瓶頸時，沒有合適的方法提高精度，那么可以考慮尋找一個“中介”，而這個“中介”應(yīng)該具有“在變量產(chǎn)生微小變化時能放大這種變化，或者用另一種形式體現(xiàn)這種變化”的特性，從而測量變得可行。而該實驗中，zui終效果就是我們可以直接通過顏色深淺大致看出濃度的不同。這一點很值得思考。
另外由于操作不熟練、不仔細(xì)，也帶來了一些粗大誤差，如無一抗（10）。這是我們實驗中應(yīng)該避免的。
