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海洋大學(xué)大鼠ELISA實驗報告

2013-10-18  閱讀(1575)

海洋大學(xué)大鼠ELISA實驗報告

實驗名稱:

   酶聯(lián)免疫吸附劑測定

 

實驗原理:  

     酶聯(lián)免疫吸附測定是一種免疫測定技術(shù)。測定中,先使抗原吸附在固相載體上,然后加待測的抗體,再用某種酶標(biāo)記抗體,形成抗原-抗體-酶標(biāo)記抗體的“雙抗體夾心”,此時酶仍保有活性,同時標(biāo)記抗體亦有免疫活性。之后再加入酶的底物,在酶的催化下產(chǎn)生反應(yīng)并產(chǎn)生有色物,顏色深淺與待測物質(zhì)的量直接相關(guān)。至此,酶的催化放大作用與免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合,提高了測定的準(zhǔn)確性與靈敏度。  

 

實驗材料與試劑:  

1.聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板(平板, 96孔)。

2.酶聯(lián)免疫檢測儀。 

3.辣根過氧化物酶羊抗兔IgG。 

4.包被液:0.05 mol/L  碳酸緩沖液(pH 9.6): Na2CO3  0.15g, NaHCO3  0.293g, 蒸餾水稀釋至100 ml。

5.稀釋液(PBS-Tween): NaCl  8g,  KCl   0.2g,  KH2PO4   0.2g,   Na2HPO4·12H2O  2.9g, Tween-20,0.5ml,蒸餾水加至1000ml。

6.洗滌液:同稀釋液。 

7.封閉液:0.5 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA(用PBS配制)。

8.鄰苯二胺溶液(底物):  配制:   0.1 mol/L 檸檬酸 (2.1g/100ml), 取6.1ml,  0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O (7.163g/100ml), 取6.4ml,  加蒸餾水12.5ml,   取鄰苯二胺8mg(溶解);  臨用前加30 % (體積分?jǐn)?shù))H2O2  40μl。

9.終止液:2 mol/L H2SO4。

 

實驗步驟: 

1.包被抗原: 用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋, 一般為1~10μg/孔,每孔加200μl, 37 ℃溫育30min。 

2.洗滌:倒盡板孔中液體,加200μl洗滌液,反復(fù)三次,zui后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上,使孔中洗滌液流盡。 

3.加封閉液200μl,37 ℃溫育30min。 

4.洗滌同2。

5.加被檢血清: 用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,每孔200μl。同時作稀釋液對照。37 ℃溫育30min。

6.洗滌同2。 

7.加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200μl,  37 ℃溫育30min。

8.洗滌同2。 

9.加底物:鄰苯二胺溶液加200μl,室溫暗處5min。

10.加終止液:每孔50μl。 

11.觀察結(jié)果:用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄OD490nm讀數(shù)。

 

實驗結(jié)果:

數(shù)據(jù)如下:

實驗討論:  

1.無一抗(10)數(shù)據(jù)值存在異常。理論上應(yīng)趨近于零??赡苁怯捎谑芪廴舅?,實驗現(xiàn)象比較清晰,隨濃度由濃到稀,顏色由深黃漸變?yōu)闇\黃。 

2.線性關(guān)系比較明顯。但斜率隨濃度減小而有所增大。這可能是在使用取液器時有氣泡混入,導(dǎo)致實際濃度低于理論上的濃度。

3.組號(2)(4)(5)中3個樣本數(shù)據(jù)差別較大,可能是因為配血清時混合不夠均勻所致。  

 

     這個實驗采用了間接法測定,利用酶的催化放大作用提高了檢測的靈敏度。作為一名精儀系的學(xué)生,這給予我的啟示就是,在直接測量精度如果遇到瓶頸時,沒有合適的方法提高精度,那么可以考慮尋找一個“中介”,而這個“中介”應(yīng)該具有“在變量產(chǎn)生微小變化時能放大這種變化,或者用另一種形式體現(xiàn)這種變化”的特性,從而測量變得可行。而該實驗中,zui終效果就是我們可以直接通過顏色深淺大致看出濃度的不同。這一點很值得思考。

 

     另外由于操作不熟練、不仔細(xì),也帶來了一些粗大誤差,如無一抗(10)。這是我們實驗中應(yīng)該避免的。



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