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組織結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶產(chǎn)品說明書

2019-11-15  閱讀(798)

組織結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶(cNOS/NOS3/eNOS)活性熒光定量檢測

試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

組織結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶(cNOS/NOS3/eNOS)活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過一氧化氮合成酶反應(yīng)系統(tǒng),內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶敏感性抑制劑存在與否的情況下,由底物L-氨酸被催化產(chǎn)生一氧化氮,進(jìn)而與熒光探針二氨基熒光素反應(yīng),生成強(qiáng)烈熒光產(chǎn)物三唑并熒光素,通過其相對(duì)熒光峰值的變化,即采用熒光法來測定樣品中結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的其適用于各種組織裂解懸液樣品(動(dòng)物、人體、昆蟲等)的結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase;NOS;EC1.14.13.39)是鈣調(diào)蛋白calmodulin)依賴性或含鈣調(diào)蛋白細(xì)胞色素p450類血紅素蛋白hemoprotein),分子量為130160KD的二體蛋白,其催化結(jié)構(gòu)域包括還原酶、加氧酶、黃素腺嘌呤二核苷酸Flavin adenine dinucleotide;FAD)、核黃素苷酸flavin mononucleotide;FMN)等要素,在輔助因四氫生物喋呤tetrahydro-biopterin)的幫助下,進(jìn)行非芳香類氨基L-氨酸L-arginine)的5端電子氧化。一氧化氮合成酶催化L-氨酸末端的氮原子,在還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸NADPH和氧氣的參與下,成為一氧化氮(nitric oxide)的合成反應(yīng)。一氧化氮合成酶有三種異構(gòu)體:神經(jīng)元型(neuronal NOS;nNOS;)、內(nèi)皮細(xì)胞型(endothelial NOS;eNOS;NOS3)和巨噬細(xì)胞型(macrophage NOS;mNOS;NOS2),前二者為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合成酶(constitutive NOS;cNOS),后者為誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible NOS;iNOS)。其中內(nèi)皮細(xì)胞型(eNOS)為膜相關(guān)性蛋白(豆蔻?;?;myristoylation),分布在心血管以及腦血管組織,含有N-末端加氧酶、C-末端還原酶和鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其功能在于作為血管保護(hù)分子,維持血管緊張度(vascular tone)和完整性,同時(shí)受到鈣離子、鈣調(diào)蛋白、磷酸化等調(diào)節(jié)。基于底物L-氨酸eNOS敏感性抑制劑亞胺乙基鳥氨酸(L-N5(1-iminoethyl)- L-ornithine;L-NIO)存在與否的情況下,通過NADPH和氧氣的參與,由一氧化氮合成酶催化產(chǎn)生一氧化氮?dú)怏w和瓜氨酸citrulline;進(jìn)而使用特異性熒光探針二氨基熒光素(4,5-diaminofluorescein;DAF-2)與一氧化氮反應(yīng),生成強(qiáng)烈熒光產(chǎn)物三唑并熒光素(triazolofluorescein;DAF-2T),通過其相對(duì)熒光峰值的變化激發(fā)波長495nm,散發(fā)波長515nm,來定量分析結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶特異活性。其反應(yīng)方式為: 

 

eNOS

L-arginine  +  NADPH  +  O2      nitric oxide  +  citrulline  +  NADP

L-NIO

 

DAF-2  +  NO +  O2    DAF-2T

   

用戶自備

 

*緩沖液(Reagent H):用于檢測純化內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合成酶或體外檢測

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管:用于制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的容器

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品處理

DOUNCE勻漿器:用于裂解組織樣品

恒溫水槽:用于反應(yīng)孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光徑比色皿:用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀:用于樣品熒光分析



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