*節(jié) 概  述

在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA.

轉(zhuǎn)化（Transformation）是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如電擊法，CaCl2，RbCl（KCl）等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（Compenent cells）。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞）。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl（KCl） 法，RbCl（KCl）法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率*可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無(wú)菌，gan，，油，于-70℃保存（半年），因此 CaCl2法為使用更廣泛。

為了提高轉(zhuǎn)化效率， 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：

1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌，從-70℃或-20℃，gan，油，保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來(lái)控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右（不同的菌株情況有所不同），這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。

2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA（cccDNA）。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。

3. 試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2等均需是zui高純度的（GR.或AR.），并用超純水配制，分裝保存于干燥的冷暗處。

4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染， 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。

本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH菌株為受體細(xì)胞，并用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后與pBS質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐*抗性基因（Ampr），可通過(guò)Amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。
第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑

一、材料

E. coli DH5α菌株： Rˉ，Mˉ，Ampˉ；pBS質(zhì)粒DNA：購(gòu)買(mǎi)或?qū)嶒?yàn)室自制，eppendorf管。

二、設(shè)備

恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，無(wú)菌工作臺(tái)，低溫冰箱，恒溫水浴鍋，制冰機(jī)，分光光度計(jì)，微量移液槍。

三、試劑

1.LB固體和液體培養(yǎng)基。

2.Amp母液。

3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右，加入Amp儲(chǔ)存液，使終濃度為50ug/ml，搖勻后鋪板。

4.麥康凱培養(yǎng)基（Maconkey Agar）：取52g麥康凱瓊脂，加蒸餾水1000ml，微火煮沸至*溶解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50ug/ml，然后搖勻后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液：稱取0.28g CaCl2（無(wú)水，分析純），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高壓滅菌。

6.含15%，gan，油，的0.05mol/L CaCl2：稱取0.28g CaCl2（無(wú)水，分析純），溶于50ml重蒸水中，加入15ml，gan，油，定容至100ml，高壓滅菌。

第三節(jié) 操作步驟

一、受體菌的培養(yǎng)

從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落，接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 =0.5左右。

二、感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2 法）

1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4℃下3000g離心10分鐘。

2、棄去上清，用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15-30分鐘后，4℃下3000g離心10分鐘。

3、棄去上清，加入4ml預(yù)冷含15%，gan，油，的0.05mol/L的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。

4、感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份，貯存于-70℃可保存半年。
三、轉(zhuǎn)化

1、從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。

2、加入pBS質(zhì)粒DNA溶液（含量不超過(guò)50ng，體積不超過(guò)10μl），輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。

3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。

4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基（不含Amp），混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）。

5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液*被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。

同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照：

對(duì)照組1： 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒(méi)有菌落出現(xiàn)。

對(duì)照組2：以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液，但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。

四、計(jì)算轉(zhuǎn)化率

統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。

轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：

轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積

轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)/每mg質(zhì)粒DNA）=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量（mg）

感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)=對(duì)照組2菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積/涂板菌液體積

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)

[注意] 本實(shí)驗(yàn)方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。有的轉(zhuǎn)化效率高，需將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板，而有的轉(zhuǎn)化效率低，涂板時(shí)必須將菌液濃縮（如離心），才能較準(zhǔn)確的計(jì)算轉(zhuǎn)化率。上海友騰生物傾力為客戶提供上萬(wàn)種科研試劑，提供*、zui全、zui有效的科研試劑產(chǎn)品，質(zhì)量被全國(guó)各大院?？蒲袡C(jī)構(gòu)認(rèn)可。同時(shí)代理IBL，DRG ，R&D，HCB等品牌*試劑盒。