細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)

摘要：在293T細(xì)胞中過表達(dá)human pescadillo（PES1）基因，利用免疫熒光技術(shù)研究PES1在細(xì)胞中的表達(dá)和定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PES1定位于細(xì)胞核的核仁。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究PES1基因的功能提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
關(guān)鍵詞：PES1，免疫熒光， 蛋白定位，293T

一、 實(shí)驗(yàn)原理
免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
使用過表達(dá)PES1-3FLAG的慢病毒感染293T細(xì)胞，利用Anti-FLAG抗體進(jìn)行免疫熒光，觀察PES1蛋白的表達(dá)以及在細(xì)胞中的定位。

三、 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 細(xì)胞鋪板：
細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按20-30%的匯合度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的圓形蓋玻片上。
2. 病毒感染：
病毒感染：細(xì)胞貼壁后使用PES1過表達(dá)慢病毒感染細(xì)胞，MOI =10。
3. 免疫細(xì)胞化學(xué)染色：
1) 固定：病毒感染72h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔用500μl DPBS洗細(xì)胞2次，之后每孔加250μl 4% 多聚甲醛，室溫固定15-20min。
2) 封閉：封閉液配制如下：
                  94%    0.1M TBS
                  3%     Normal Goat Serum
                  3%     10% Triton X-100
去除TBS，24孔板每個(gè)孔加入500μl封閉液，室溫孵育1h封閉。
3) 染一抗：吸出封閉液，每個(gè)孔再加入500μl封閉液，根據(jù)1:1000加入一抗，4℃孵育過夜。
4) 染二抗：一抗染色結(jié)束后，移去含一抗的封閉液，用1ml TBS洗三次。吸出TBS，每個(gè)孔加入500μl封閉液孵育30min。按1:500加入二抗，室溫?fù)u晃孵育60-120min。可在孵育60min后加入終濃度為100ng/ml的DAPI繼續(xù)孵育。由于二抗帶有熒光標(biāo)記，熒光信號(hào)容易淬滅，加入二抗及之后的過程需注意避光。二抗孵育結(jié)束后，移去含二抗的封閉液，用1ml TBS洗三次，可直接在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察或者進(jìn)行封片保存。
5) 封片：在載玻片是滴一小滴mounting medium，小心地將cover slip從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出，種植有細(xì)胞面朝下輕輕地蓋在mounting medium。4℃孵育過夜晾干。過程中要注意避免產(chǎn)生氣泡，mounting medium很粘稠，滴加的時(shí)候需小心。

4. 共聚焦熒光顯微鏡拍照：
封片后可在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，亦可置于4℃長期保存。

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

                                                                      圖1. 低倍鏡觀察PES1蛋白在293T細(xì)胞中的定位

                                                                         圖2. 高倍鏡觀察PES1蛋白在293T細(xì)胞中的定位

 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到PES1蛋白定位在細(xì)胞的核仁位置。

五、 參考文獻(xiàn)
1. Griffiths G, Parton RG, Lucocq J, van Deurs B, Brown D, Slot JW, Geuze HJ. The immunofluorescent era of membrane traffic. Trends Cell Biol. 1993 Jul;3(7):214-9.
2. Garini Y, Vermolen BJ, Young IT. From micro to nano: recent advances in high-resolution microscopy. Curr Opin Biotechnol. 2005 Feb;16(1):3-12. 
3. Tokuyasu KT. A study of positive staining of ultrathin frozen sections. J Ultrastruct Res. 1978 Jun;63(3):287-307.
4. EM, Horstmann H, Almers W, Maniak M, Soldati T. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 1998;121(3):326-42.
5. Neuhaus EM, Almers W, Soldati T. Morphology and dynamics of the endocytic pathway in Dictyosium discoideum. Mol Biol Cell. 2002 Apr;13(4):1390-407.