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上海誠凜生物科技有限公司

黃芪甲苷對體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞影響的實驗研究

時間:2014-4-16閱讀:491
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黃芪甲苷對體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞影響的實驗研究
     血管生成(angiogenesis)在人體正常組織臟器發(fā)育以及 疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。血管生成主要涉及 到內(nèi)皮細胞的增殖、遷移等過程。正常情況下這些過程受到 嚴密調(diào)控,而相對處于平衡狀態(tài);但當機體出現(xiàn)某種疾病時, 這種平衡機制被某些因素所打破,造成血管生成的障礙。近 年來,針對疾病狀態(tài)下異常的血管新生已經(jīng)成為國內(nèi)外研 究的熱點。56腎切大鼠模型是慢性腎臟病進行性進展的經(jīng) 典動物模型。在該大鼠模型中,內(nèi)皮細胞的受損及凋亡表現(xiàn) 突出,尤其在腎切812周時,凋亡的內(nèi)皮細胞數(shù)量有一個 加劇的過程。在這個階段里,如果加用某些藥物干預(yù),則 可對內(nèi)皮細胞的凋亡起到一定的保護作用,并可以延緩慢 性腎臟病的進展?,F(xiàn)已有眾多研究證明黃芪等中藥具有改 善內(nèi)皮細胞功能,促進內(nèi)皮細胞修復(fù)及再生等藥理作用。 本實驗研究以中藥血清藥理學為實驗方法,從體外實驗的 角度探討黃芪甲苷對以腎衰模型大鼠血清干預(yù)培養(yǎng)而受損 的內(nèi)皮細胞的影響。


1 材料與方法


11 藥品及試劑RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司) 胎牛血清(FCS,美國Hycolon公司);四甲基偶氮唑鹽 (MTT,美國Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO)(天津市福晨 化學試劑廠);黃芪甲苷標準品并由l%羧甲基纖維素鈉溶解配成溶液。


12 儀器設(shè)備超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠);C02 細胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司);倒置顯微鏡(K70、CKX31 OLYMPUS公司);數(shù)碼照相機(C7070 EtOLYMPUS );酶標儀(美國BioRad公司);aeeu-jetpro移液槍(德國 Ependof公司);AL204電子天平(METFLER TOLEDO上海 有限公司)。


13 實驗動物健康雄性Wistar大鼠30只,體重250 320 g,SPF(中科院上海藥物所提供)。


14 模型制備及各實驗用血清的制備方法正常Wismr 大鼠30只,其中l0只正常血清組:飼養(yǎng)12周后處死采血, 以制備正常大鼠血清;10只腎衰模型血清組:適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,以OrmrodMiller所采用的改良56腎切法,進行 56腎切除手術(shù),并飼養(yǎng)12周后處死取血,以制備腎衰模型 大鼠血清;10只黃芪甲苷給藥正常血清組:正常飼養(yǎng)12 后,按以下方法以黃芪甲苷標準品配制的溶液進行灌胃,并 制備實驗用黃芪甲苷給藥正常大鼠含藥血清。


15 HUVEC內(nèi)皮細胞系的復(fù)蘇從液氮中取出凍存HU VEC細胞,快速解凍;將凍存細胞液L從凍存管中移出)加入 到裝有10ml的無血清培養(yǎng)液的小離心管中,輕輕混勻;離 C~,(12oo rmp,5分鐘);棄上清;加入10ml 10%培養(yǎng)液,反復(fù)吹打混勻;接種細胞到培養(yǎng)瓶(5m1),置于37 C02溫箱中 培養(yǎng)。


16 M ITr法檢測各組細胞增殖能力 收集對數(shù)期HUVEC細胞,調(diào)整細胞懸液濃度,分于96 孔板,調(diào)整細胞數(shù)為1 x 104/孑L100ul;置37 、5C02 箱以10FCS的培養(yǎng)液培養(yǎng),使細胞貼壁24小時;用無血 清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24小時;換上以不同的實驗用血清配制 的細胞培養(yǎng)液各200 1/孔,繼續(xù)培養(yǎng);共分三組:1)正常血 清組(10%正常大鼠血清+901640培養(yǎng)液);2)腎衰血清 (5%腎衰模型大鼠血清+5%正常大鼠血清+901640 培養(yǎng)液);3)黃芪甲苷干預(yù)腎衰血清組(5%腎衰模型大鼠血 +5%黃芪甲苷含藥大鼠血清+901640培養(yǎng)液)。觀察 12,24,48小時3個時問點的各組細胞增殖的能力;小心吸 去上清,PBS輕輕洗滌,再次棄上清;每孔加入100ul新鮮 培養(yǎng)液,再加入20ul 5%的MTF溶液,繼續(xù)培養(yǎng)3 h;終止培 養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液;每孔加入100ul二甲基亞砜 (DMSO),置溫箱中5rain,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫 檢測儀490nm處測量各孔的吸光值;同時,每個時問點設(shè) 置二個調(diào)零孑L(培養(yǎng)基、Mr丌、二甲基亞砜),每實驗組沒定 6復(fù)孔。


17 內(nèi)皮細胞遷移實驗(劃痕實驗)檢測細胞遷移能力 HUVEC細胞按每孔1 x l05500 I接種于24 板;正常培養(yǎng)24小時后棄去培養(yǎng)液,換上只含有05FCS 的培養(yǎng)液,各孔500ul,持續(xù)24小時以達到細胞同步化;換 上以不同的實驗用血清配制的細胞培養(yǎng)液各500 1/孑L,實 驗分組同上;用單位為1001的移液器滴頭在每個孔中沿 培養(yǎng)板底部呈”一”字形劃痕,在100倍倒置顯微鏡下每 孔任意選取3個視野照相以記錄劃痕區(qū)的相對距離;按 500 1/孔加入不同血清配制的培養(yǎng)液,每個組設(shè)3個復(fù)孔, 繼續(xù)培養(yǎng);18小時后,照相并記錄加藥后劃痕區(qū)的相對距 離,并計算各組細胞平均遷移距離,并計算其細胞遷移率。


18 統(tǒng)計方法以SPSS150統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析,使用均 數(shù)±標準差(X±S)描述,正常血清組與腎衰血清組之間, 以及腎衰血清組與黃芪甲苷干預(yù)’腎衰血清組之間分別以獨 立樣本資料£檢驗(IndependentSample T Test)統(tǒng)計方法實 現(xiàn),以P
2
結(jié)果


21 MTT檢測結(jié)果


與正常血清組比較,在不同組血清培養(yǎng)12小時以及 24小時時,三組血清的MTT吸光度值無明顯差異(P>0 05);在繼續(xù)培養(yǎng)干預(yù)到48小時時,腎衰血清組MTT吸光 度較止常血清組顯著降低(P<001)。與腎衰血清組相比,黃芪甲苷干預(yù)腎衰血清組M1Tr吸光度值有所提高(P<005)。


22 內(nèi)皮細胞遷移實驗(劃痕實驗)檢測細胞遷移能力 與正常血清組比較,腎衰血清組在培養(yǎng)18小時后細胞 的遷移率明顯降低(P<001);而黃芪甲苷干預(yù)腎衰血清組 的細胞遷移率較腎衰血清組明顯升高(P<001)。(見表2)


3
討論


根據(jù)中醫(yī)理論,黃芪是通過益氣扶正等機制保護腎臟, 從而延緩。圩功能的進展及其進行性惡化?!端貑?middot;通評虛實 論》說:“精氣奪則需”。慢性。腎臟病病程纏綿,久病多虛,及 至慢性腎衰,其虛損之程度必然更重,臨床可表現(xiàn)為腰酸腰 痛、神疲乏力、面色痿黃或無華等癥。因此,治病求本、扶助 正氣是治療該病的主線。黃芪味甘,性微溫,歸脾、肺經(jīng)。有 益氣扶陽利尿之功,補氣之力甚佳,為治療氣虛倦怠的要 藥?!侗窘?jīng)逢原》日該藥“能補五臟諸虛”。


本實驗從黃芪的主要有效成分一一黃芪甲苷人手,以中 藥血清藥理學及體外培養(yǎng)HUVEC細胞為實驗方法,提示 該有效成分可以通過改善受損內(nèi)皮細胞的增殖能力及遷移 能力等途徑,在一定程度上起到修復(fù)內(nèi)皮細胞的作用;從而 更進一步地揭示,該藥能通過保護血管內(nèi)皮細胞而達到保 護殘存腎單位,而延緩慢性腎臟病的進展。

 

 

 

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