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免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)中的操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)

時(shí)間:2015-7-20閱讀:1467
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一、免疫熒光的標(biāo)本制作的基本程序同DAB顯色的免疫組化,不同點(diǎn)如下:


1.  免疫熒光不需要使用雙氧水處理,封閉和一抗孵育與其它相同。


2.  免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育,孵育時(shí)間根據(jù)抗體的工作濃度確定。


3.  二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。


4.  免疫熒光在封片使用封片劑或甘油:0.01MPBS 11)。


5.  條件許可可以購(gòu)買(mǎi)防淬滅的試劑加入封片劑中,標(biāo)本可以保存更久。


6.  熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要閉光。


7.  熒光抗體染色假陽(yáng)性可能會(huì)多,需要設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照。


二、注意事項(xiàng)


1.  熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)使熒光減弱。


2.  每次試驗(yàn)時(shí),需設(shè)置以下三種對(duì)照:


1 陽(yáng)性對(duì)照:陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物


2 陰性對(duì)照:陰性血清+熒光標(biāo)記物


3 熒光標(biāo)記物對(duì)照:PBS+熒光標(biāo)記物


三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談

1.  選取primary antibodies時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物,用來(lái)源于rabbitrat的抗體,secondary antibodies則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的,用donkey anti-rabbit-FITC(綠)和donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。

2.  我的做法是兩種primary antibodies同時(shí)孵育,然后兩種secondary antibodies同時(shí)孵育??贵w濃度、孵育時(shí)間要認(rèn)真摸索,感覺(jué)primary antibodies 4度孵育過(guò)夜比較好,背景比較干凈。

3.  我的陽(yáng)性對(duì)照采用的是陽(yáng)性組織切片,陰性對(duì)照則分別是rabittratIgG,熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。

4.  Block用的血清使secondary antibody來(lái)源動(dòng)物的血清,我的是10%正常donkey血清。

5.  其余同一般操作。


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