一、免疫熒光的標(biāo)本制作的基本程序同DAB顯色的免疫組化，不同點(diǎn)如下：

1.  免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同。

2.  免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育，孵育時(shí)間根據(jù)抗體的工作濃度確定。

3.  二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。

4.  免疫熒光在封片使用封片劑或甘油：0.01MPBS （1：1）。

5.  條件許可可以購買防淬滅的試劑加入封片劑中，標(biāo)本可以保存更久。

6.  熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要閉光。

7.  熒光抗體染色假陽性可能會(huì)多，需要設(shè)定陽性和陰性對(duì)照。

二、注意事項(xiàng)

1.  熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過長，會(huì)使熒光減弱。

2.  每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：

（1） 陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物

（2） 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物

（3） 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物

三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談

1.  選取primary antibodies時(shí)要來源于兩種不同的動(dòng)物，用來源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，用donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。

2.  我的做法是兩種primary antibodies同時(shí)孵育，然后兩種secondary antibodies同時(shí)孵育?？贵w濃度、孵育時(shí)間要認(rèn)真摸索，感覺primary antibodies 4度孵育過夜比較好，背景比較干凈。

3.  我的陽性對(duì)照采用的是陽性組織切片，陰性對(duì)照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。

4.  Block用的血清使secondary antibody來源動(dòng)物的血清，我的是10%正常donkey血清。

5.  其余同一般操作。