在染色體的復(fù)制過(guò)程中同一條染色體上的兩條染色單體所發(fā)生的遺傳物質(zhì)等位點(diǎn)交換，稱為姐妹染色單體互換(sister chromatid exchange，SCE)。SCE技術(shù)是指能夠顯示姊妹染色單體在相同位置上同源片段的交換。由于SCE比染色體畸變敏感，故成為評(píng)價(jià)染色體損傷修復(fù)的一項(xiàng)遺傳學(xué)指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)、人類DNA損傷修復(fù)缺陷及檢測(cè)致突變和致癌物質(zhì)等領(lǐng)域。

    5一溴脫氧*核苷(5一bromo一2 deoxyuridine，BrdU)是脫氧胸腺嘧啶核苷(deoxythymidine，TdR)的類似物，當(dāng)細(xì)胞在含有BrdU的培養(yǎng)液中增殖時(shí)，BrdU可取代TdR而摻人到新復(fù)制成的DNA子鏈。由于DNA的復(fù)制是以半保留的方式進(jìn)行的，故當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷了兩個(gè)增殖周期后，染色體中的DNA雙股單鏈或者都摻入了BrdU，或者其中一股摻入了BrdU另一股則不含BrdU。由于雙股都含BrdlJ的DNA分子具有螺旋化程度較低的特性，從而降低了與某些染色劑的親和力，故當(dāng)用Giemsa染液染色時(shí)，一條染色單體著色較淺；而另一條染色單體由于所含的DNA分子僅有一股單鏈摻入了BrdU，可被Giemsa深染。所以如果姊妹染色單體出現(xiàn)了片段的交換，在互換處可見(jiàn)一界限明顯、顏色深淺對(duì)稱的互換片段。

一、材料與方法

(一)實(shí)驗(yàn)材料

1.受試對(duì)象人外周血。

2．*(20μg／ml)。

3．2×SSC。

4．Giemsa染液。

(二)實(shí)驗(yàn)方法

1．人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)(見(jiàn)本章*節(jié))，在收獲細(xì)胞前2～3h(即培養(yǎng)到69～70h)加*(終濃度為O．2μg／ml)。

2．制片(見(jiàn)本章*節(jié))。

3．標(biāo)本老化將制好的染色體玻片置37℃培養(yǎng)箱2d或在60℃干烤箱烤片2h。

4．差別染色(紫外線照射法)

(1)將老化好的染色體玻片標(biāo)本放人一平皿中(將牙簽放在玻片下面)，在玻片上蓋一張稍大些的擦鏡紙，紙的四邊垂于平皿中，滴加2×SSC液到紙上，使擦鏡紙全部濕潤(rùn)，平皿中放2×SSC溶液與玻片水平，保證有充足的2×SSC液滲至標(biāo)本上保持標(biāo)本濕潤(rùn)。

(2)將平皿置于56℃的水浴箱中，使平皿底部接觸水面。

(3)在水浴箱上架一支20W的紫外線燈，使燈管與標(biāo)本的距離6cm左右，照射30min。。

(4)照射完畢，用鑷子輕輕揭去擦鏡紙，用自來(lái)水輕輕沖洗玻片。

(5)1：9Giemsa染液染色5～10min(著色過(guò)深影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。

(6)自來(lái)水沖洗晾干后，觀察，拍照。

(7)計(jì)數(shù)SCE。

二、結(jié)果觀察

(一)預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在某些進(jìn)入第二次復(fù)制中期的分裂象中，清晰可見(jiàn)姊妹染色單體分染為一深一淺圖像，可觀察到姊妹染色單體同源片段等位交換相。

(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察分析

1．選擇在加入BrdU之后經(jīng)過(guò)兩個(gè)復(fù)制周期，姊妹染色單體分化著色清晰，染色體分散良好，長(zhǎng)短合適和染色數(shù)目完整的中期分裂，進(jìn)行觀察分析。

2．SCE交換次數(shù)判定染色體某臂端部交換計(jì)1次交換，臂間交換計(jì)2次，著絲粒處發(fā)生交換(需排除染色體在此發(fā)生扭曲)計(jì)1次。

3．每個(gè)標(biāo)本分析30～50個(gè)中期分裂象。

4．SCE率計(jì)算

SCE率=累計(jì)互換數(shù)／觀察細(xì)胞數(shù)=SCE／細(xì)胞

5．細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)計(jì)數(shù)

(1)每個(gè)樣品分析中期細(xì)胞100個(gè)。

(2)計(jì)算Ml～M5，細(xì)胞百分比。

(3)根據(jù)姐妹染色單體形態(tài)分染程度，分類形態(tài)規(guī)定

三、注意事項(xiàng)

(一)BrdU溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，一次用不完，必須用黑紙(簾)包裹避光，4℃冰箱保存。

(二)BrdU是強(qiáng)致突變劑，使用濃度不易太高，否則會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。25mg／ml劑量不影響細(xì)胞增殖。用紫外線照射誘發(fā)姐妹染色單體分化時(shí)，如紫外燈功率大，照射時(shí)間應(yīng)相應(yīng)減少。一般在20W的紫外燈距離6cm左右；15w紫外線燈距離4cm左右。溫度要控制在50℃～60℃(冬天是55℃～60℃)，但不應(yīng)超過(guò)60℃，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高都會(huì)造成染色體膨脹。

(5)影響SCE的因素包括地區(qū)與環(huán)境、BrdU濃度、動(dòng)物種類、染色體長(zhǎng)度、培養(yǎng)時(shí)間與溫度。