免疫組化試劑的標(biāo)準(zhǔn)化

    要求試劑公司提供標(biāo)準(zhǔn)化的試劑，并附詳細(xì)的試劑說(shuō)明書(shū)，包括抗體的來(lái)源、免疫球蛋白的亞類(lèi)、單抗或多抗、使用稀釋度、使用流程和注意事項(xiàng)、洗滌時(shí)緩沖液的適宜離子強(qiáng)度和PH值等?？贵w的選擇是開(kāi)展免疫組化zui重要環(huán)節(jié)之一。目前，抗體大部分來(lái)源于國(guó)外，抗體種類(lèi)繁多，生產(chǎn)廠家各異，再經(jīng)過(guò)中介渠道致有效期縮短，影響抗體效價(jià)甚至陽(yáng)性不表達(dá)，因此對(duì)購(gòu)入的抗體首先要進(jìn)行檢測(cè)。理想的抗體應(yīng)具備特異性強(qiáng)、敏感性高和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)。

    現(xiàn)實(shí)市場(chǎng)銷(xiāo)售的一抗多為即用型，對(duì)抗體的滴度無(wú)須摸索，但對(duì)于濃縮型一抗，則應(yīng)摸索出*的工作滴度，抗體的濃度過(guò)高或過(guò)低都將可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，應(yīng)該用一個(gè)適當(dāng)?shù)南♂尪鹊玫?的抗原染色強(qiáng)度和zui低的背景著色。靈敏度高而極易控制背景的檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒是zui為理想也是免疫組化染色優(yōu)劣的關(guān)鍵，根據(jù)免疫組化技術(shù)發(fā)展至今第三代SP試劑盒更優(yōu)于其它試劑盒 (ABC、PAP等)。但應(yīng)注意檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)與一抗來(lái)源相匹配，否則檢不出目的物。一抗的作用時(shí)間是4℃過(guò)夜，也可以用37℃*lh，但后者在染色過(guò)程中應(yīng)控制好溫度、時(shí)間及其它抗體稀釋度。

（1）抗體選用：一般來(lái)講，多克隆抗體的抗原專(zhuān)一性較差，非特異性反應(yīng)較明顯，效價(jià)不太穩(wěn)定；但多克隆抗體制備簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，抗體效價(jià)較高，稀釋度一般在1∶100~1000之間，適應(yīng)性強(qiáng)，有部分多抗表達(dá)抗原特異性較好，如TG和PSA等，多抗CD3對(duì)石蠟切片標(biāo)記T細(xì)胞適應(yīng)性強(qiáng)，陽(yáng)性率高。單克隆抗體的抗原專(zhuān)一性強(qiáng)，質(zhì)量和效價(jià)穩(wěn)定，非特異性反應(yīng)較少，標(biāo)記結(jié)果可靠，但單克隆抗體制備復(fù)雜，價(jià)格昂貴，抗體效價(jià)較低，稀釋度在1∶50~100，如單抗CD3只能在冷凍切片上表達(dá)，難在石蠟切片顯色。目前市場(chǎng)上常有分裝、稀釋抗體出售，這種抗體有使用經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但稀釋抗體減少了蛋白分子間互相保護(hù)的作用，因而效價(jià)不穩(wěn)定，不易長(zhǎng)期保存。進(jìn)口試劑質(zhì)量較好，但價(jià)格昂貴，特別是常用的第二抗體，染色過(guò)程短，敏感性高。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇合適的抗體。

（2）抗體分裝：購(gòu)入的抗體（除非只夠數(shù)次用量）一般需要分裝在多個(gè)安瓿中，根據(jù)月需要量，大致每安瓿含5~20微升。除留下一支現(xiàn)用，其余應(yīng)立即放置低溫冰箱內(nèi)貯存（-20℃以下）。用一支取一支，以免長(zhǎng)期保存在4℃冰箱內(nèi)失效。

（3）抗體稀釋?zhuān)嚎贵w使用一般按其工作濃度稀釋?zhuān)?∶100，1∶1000等等。一次用不完的抗體可保存在4 ℃冰箱內(nèi)，盡量在1~2月內(nèi)用完，而不要放在4 ℃冰箱的冰格中，因?yàn)闇囟仍? ℃以下，抗體會(huì)很快結(jié)冰，再次使用時(shí)又要融化，這樣幾次凍融，抗體效價(jià)會(huì)急劇下降而失效。用作抗體的稀釋液，在夏天溫度很高時(shí)，加入少許防腐劑如疊氮鈉、柳硫汞等，以免在切片上作用時(shí)間超過(guò)10小時(shí)而生霉菌。

（4）無(wú)菌與消：保持使用中的抗體無(wú)菌是困難的，但是與抗體接觸的工具如滴管、吸管、試管、安瓿以及加樣器等經(jīng)過(guò)消毒，盡量減少污染的機(jī)會(huì)，不然抗體極易污染細(xì)菌與霉菌，而迅速發(fā)生渾濁沉淀而失效。