隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在藥理學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，特別是藥物對機(jī)體的藥效作用，有否毒性作用，必須通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)則可通過藥物對培養(yǎng)細(xì)胞的作用來判定。同時(shí)體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也為深入探討藥物作用機(jī)制和有效藥物的篩選提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
一、細(xì)胞選擇
利用組織細(xì)胞做藥物檢測時(shí)，首先要考慮選擇什么細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，細(xì)胞選擇不當(dāng)，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性和參考價(jià)值。在藥物效應(yīng)不明的情況下，對細(xì)胞的選擇可不必十分嚴(yán)格。如已知藥物有特殊效應(yīng)或欲求得對某一類細(xì)胞產(chǎn)生特定作用時(shí)，應(yīng)盡量選用相應(yīng)的細(xì)胞。進(jìn)行藥物測試實(shí)驗(yàn)時(shí)，對照細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)組合中不可少的組成部分，細(xì)胞種類的應(yīng)用原則也是符合性越大越好。
二、檢測藥物
zui適宜的藥物劑量應(yīng)是：對正常細(xì)胞無影響或傷害zui小(能恢復(fù))，而殺傷效應(yīng)或特異性zui大的藥物劑量。用培養(yǎng)細(xì)胞作藥物測試，用經(jīng)驗(yàn)測試法是比較實(shí)用的。即應(yīng)用在一定藥量范圍內(nèi)遞增藥量的測試辦法；確定一組藥量梯度數(shù)值，安排一組培養(yǎng)細(xì)胞，用多孔板培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行檢測，分別向各組培養(yǎng)細(xì)胞中加入不同的藥量。作用一段時(shí)間后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法測試死活細(xì)胞比數(shù)，取50％死亡細(xì)胞組作為粗ID(近似值)。為求得確切的ID，尚需做進(jìn)一步的測試直至找到合適劑量為止，比較快和合理的辦法是觀察藥物對細(xì)胞形態(tài)和增殖生長的影響。
三、測試程序中的注意事項(xiàng)
(一)細(xì)胞
1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞如藥效特點(diǎn)不明，可用HeLa、KB等通用癌細(xì)胞系。細(xì)胞引入后，選生長狀態(tài)良好的原瓶細(xì)胞。消化分離后接種人大瓶備用，待大瓶細(xì)胞增長至足夠數(shù)量后，取l～2瓶細(xì)胞用消化制成細(xì)胞懸液，分成等量接種入若干多孔板或15ml培養(yǎng)瓶中。用培養(yǎng)瓶測試時(shí)，一般每一劑量組至少接種21瓶；分7組，每組3瓶細(xì)胞。
2．對照細(xì)胞根據(jù)被測藥物性質(zhì)和要求應(yīng)選用與之相應(yīng)的二倍體細(xì)胞做對照；一切培養(yǎng)條件均應(yīng)與實(shí)驗(yàn)組相一致。僅用一種癌細(xì)胞，分成加藥組和不加藥組．而不用相應(yīng)正常細(xì)胞作為對照組是不正確的。
(二)加藥
1．加藥時(shí)間給藥時(shí)間可采用接種前給藥和生長中給藥兩種方法。生長中給藥是常用的測試藥物方法。進(jìn)行生長中加藥時(shí)，取ID 50／10為實(shí)驗(yàn)劑量，加藥時(shí)間宜在接種細(xì)胞后約第48小時(shí)。
2．藥物作用持續(xù)時(shí)間 藥物在瓶皿中與細(xì)胞接觸時(shí)間不應(yīng)少于8h，一般可處理12～24h或更長。體內(nèi)用藥時(shí)，每批實(shí)驗(yàn)過程中(一般為7d)，讓藥物始終作用細(xì)胞。對照組做同樣處理，加等量的BSS或助溶劑。
(三)觀察
1．形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)胞受藥物作用后，形態(tài)上很易發(fā)生改變，如成纖維細(xì)胞突起回縮、上皮細(xì)胞相互分離等．這些變化在一般光學(xué)顯微鏡下很易觀察到。但這些變化不一定十分可靠，形態(tài)變化應(yīng)主要以超微結(jié)構(gòu)的改變?yōu)橐罁?jù)，觀察藥物對細(xì)胞膜、微絨毛、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒
體和染色質(zhì)等微細(xì)結(jié)構(gòu)有無影響。
2．生長和增殖培養(yǎng)中的細(xì)胞有時(shí)可能僅有生長而無增殖，特別是進(jìn)行分化的細(xì)胞更是如此。因此不能單靠細(xì)胞數(shù)量作為判定細(xì)胞增殖*的標(biāo)準(zhǔn)。其他一些現(xiàn)象如肌細(xì)胞的增粗、神經(jīng)細(xì)胞突起的增長等均為細(xì)胞生長的表現(xiàn)。
3．細(xì)胞死亡凡能引起細(xì)胞內(nèi)相互制約系統(tǒng)中一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)的紊亂，zui終導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能障礙、進(jìn)而緩解死亡的現(xiàn)象，都應(yīng)視為細(xì)胞死亡的范疇。如氰化物抑制細(xì)胞氧化磷酸化阻斷ATP供應(yīng)、干擾蛋白質(zhì)合成并抑制細(xì)胞修復(fù)等，這些作用都有一個(gè)發(fā)展過程，zui終能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此確定細(xì)胞的死亡必須有一個(gè)時(shí)間范圍。
