亚洲国产精品二区久久,日本美女后入式午夜视频在线观看,国产污视频在线观看,欧美日韩国产精品中文字幕在线观看

上海谷博實(shí)業(yè)有限公司
初級會(huì)員 | 第15年

15026509758

WB成功與否的關(guān)鍵

時(shí)間:2013/11/22閱讀:2846
分享:

                                                 WB成功與否的關(guān)鍵
嚴(yán)重影響WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵點(diǎn)有:蛋白提取,制備凝膠,電轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育,二抗孵育,化學(xué)發(fā)光,曝光時(shí)間?;旧先魏我徊綄?shí)驗(yàn)做不好都會(huì)影響它的結(jié)果,所以很多人都說WB難做就是這個(gè)原因。


首先說說蛋白提取,找一個(gè)好的細(xì)胞裂解液是做好WBzuizui重要的一步,提不好蛋白一切都是白搭。網(wǎng)上有許多的配方,大家可以慢慢去試找到一個(gè)合適自己的。

然后是凝膠的配置,這個(gè)主要是要注意目的蛋白分子量的大小要和你所配置的分離膠濃度相對應(yīng),大分子量的蛋白就要配置低濃度的膠,小分子的蛋白就要配置高濃度的膠。zui后把pH值調(diào)準(zhǔn),不使用凝膠邊緣的孔道。PS:制膠板肯定是要洗干凈的。

電轉(zhuǎn)膜的時(shí)候,注意小分子蛋白和大分子蛋白的轉(zhuǎn)膜是有區(qū)別的(濕轉(zhuǎn)):
大分子與小分子蛋白的轉(zhuǎn)膜
    大分子蛋白質(zhì)(>100KDa)
1.大分子蛋白跑的十分的慢,所以要確定分離膠的濃度不要大于8%,同時(shí)轉(zhuǎn)膜的時(shí)間還要適當(dāng)?shù)难娱L;
2.大分子蛋白質(zhì)很容易在凝膠里沉淀,阻礙轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入SDS可以阻止大分子蛋白質(zhì)沉淀,但甲醇會(huì)把SDS從蛋白質(zhì)中脫離下來,所以降低轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇的含量有利于大分子蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜;
小分子蛋白質(zhì)(<100KDa)
1.SDS會(huì)阻礙所有的蛋白質(zhì)結(jié)合到膜上,而小分子蛋白質(zhì)所受到的影響會(huì)比大分子蛋白質(zhì)大,所以如果目的蛋白的分子量比較小的話,要考慮把SDS從轉(zhuǎn)膜緩沖液中移除;
2.保持轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇的濃度在20%左右。
除了這個(gè)還要注意轉(zhuǎn)膜的電流和時(shí)間,我是轉(zhuǎn)恒流300mA,小于100KDa的轉(zhuǎn)1.5小時(shí)以內(nèi)就夠了。當(dāng)然膜,膠與濾紙之間要沒有氣泡啦!


封閉,要注意時(shí)間稍微長一點(diǎn)會(huì)更好,多于2個(gè)小時(shí)是個(gè)不錯(cuò)的建議,室溫下孵育就可以了。要注意的是做磷酸化目的蛋白的時(shí)候不能用脫脂牛奶封閉,要用BSA。


一抗孵育和二抗孵育,強(qiáng)烈建議使用好的抗體(特別是剛做WB實(shí)驗(yàn)的同仁們)??贵w出現(xiàn)問題影響結(jié)果是比較少出現(xiàn)的。一抗孵育一般建議使用1:1000的抗體稀釋比例,室溫孵育1.5小時(shí)。二抗孵育建議使用1:6000的抗體稀釋比例,室溫孵育1.5小時(shí)。(補(bǔ)充一點(diǎn),我配置的膠的厚度是0.75毫米的薄膠,上樣量是每個(gè)孔道20微克總蛋白)


zui后是化學(xué)發(fā)光,這個(gè)主要注意就是選一個(gè)比較好試劑就行了。

曝光時(shí)間是各人選擇合適的時(shí)間就可以了,主要是要注意所得的條帶不要顯得太粗就可以了。

會(huì)員登錄

×

請輸入賬號(hào)

請輸入密碼

=

請輸驗(yàn)證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏!
標(biāo)簽:
保存成功

(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我們將在第一時(shí)間回復(fù)您~
撥打電話
在線留言
成人国产亚洲精品一区二| 国产亚洲一区二区手机在线观看| 日本成人在线一区中文字幕| 日本六十五十熟女一级黄色| 女人被躁到高潮嗷嗷叫小| 精品国产99亚洲一区二区三区| 国产高清第一区第二区第一页| 大香蕉中码手机在线视频| 国产精品毛片一区视频播| 欧美日韩欧美国产中文字幕| 日本免费一区二区在线| 欧美久久精品免费看C片| 国产羞羞的视频在线观看| 国产羞羞的视频在线观看| 欧美一区二区三区男人的天堂| 日本一区二区三区四区五| 亚洲av无一区二区三区综合| 性一乱一交一免费看视频| 尤物性生活午夜在线视频| 亚洲午夜福利视频在线| 大男人在线无码直播| 欧美一区二区三区色婷婷月色| 欧美 日韩 亚洲 熟女| 国产 自拍 欧美 在线| 男人草女人的骚逼逼| 中文字幕一区二区三区中文字幕| 大鸡巴日大鸡巴在线观看| 火辣美女的操大逼| 男插女逼啪啪啪软件| 亚洲欧美一区二区爽爽爽| 亚洲一级片在线播放| 欧美性做爰片免费视频看| 综合欧美日韩一区二区三区| 为什么搜索不到裸体| 欧美一区亚洲一区视频在线观看| 丰满少妇被强入在线观看| 色橹橹欧美在线观看视频高清免费| 性色av一区二区三区天美传媒四| 成人刺激性视频在线观看| 久久久久久国产A免费观看| 留学生美女被大黑屌猛戳|