呋喃代謝物檢測試劑盒介紹（四合一）

（四合一）

1 原理及用途

本套試劑盒有四種產(chǎn)品，采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜、牛奶等樣本中的呋喃類代謝物（AOZ、AMOZ、SEM、AHD），試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的呋喃代謝物和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃代謝物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含呋喃代謝物含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中呋喃代謝物的殘留量。

2 技術(shù)指標

四種產(chǎn)品

加樣模式統(tǒng)一：50ul樣本/孔+50ul酶/孔+50ul抗體/孔。

反應(yīng)模式統(tǒng)一：25℃，45min～15min；（具體見“6 酶聯(lián)免疫試驗步驟”）

前處理方法統(tǒng)一：即處理的一個樣本可分別用于檢測四種代謝物。做添加回收時也可以將四種高標準加入同一個樣本中，一次性處理后分別用于檢測四種代謝物。（具體見“5 樣本前處理”）

2.1 試劑盒靈敏度及檢測下限

*代謝物檢測試劑盒：0.02ppb（ng/ml）

組織、肝臟…………………………0.04ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.04ppb

魚/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.1ppb

呋喃它酮代謝物檢測試劑盒：0.05ppb（ng/ml）

組織、肝臟…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.1ppb

魚/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.15ppb

*代謝物檢測試劑盒：0.05ppb（ng/ml）

組織、肝臟…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.1ppb

    魚/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.15ppb

*代謝物檢測試劑盒：0.05ppb（ng/ml）

組織、肝臟…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.1ppb

魚/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.15ppb

3 試劑盒組成

四種產(chǎn)品的“衍生化試劑、底物液A、底物液B、終止液、20X濃縮洗滌液、2X復溶液”成分統(tǒng)一，可以通用。

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、鈉、濃HCl、K₂HPO₄·3H₂O、亞硝基鐵（K₂Fe（CN）₅（NO）_?2H₂O）、ZnSO₄·7H₂O

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

    實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.36M亞硝基鐵溶液（牛奶、奶粉樣本）

11.9g亞硝基鐵加去離子水至100ml溶解。

配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶、奶粉樣本）

    29.8g硫酸鋅加去離子水至100ml溶解。

配液3：0.1M K₂HPO₄ 溶液

    稱11.4g K₂HPO_4?3H₂O加去離子水溶解定溶至500ml。

配液4：1M HCL

    8.6mL濃HCL加去離子水定容至100mL。

配液5：1M NaOH溶液

    稱取4g NaOH，加去離子水定容至100ml。

配液6：復溶液

    2×復溶液在使用前請按1:1稀釋。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 牛奶樣本處理方法

1）取5ml樣本于離心管中，加250ul 亞硝基鐵溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上清1.1ml，加4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；

3）在37℃過夜孵育（約16小時）或50℃（超過50℃時會影響分層效果）水浴孵育3小時；

4）分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯，振蕩5分鐘；

5）室溫下4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘；

6）取出2.5ml的上層液到另一個離心管中，50-60℃氮氣或空氣吹干；

7）用1ml正已烷溶解殘留物，加入1ml復溶工作液充分振蕩混合30秒；室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘；

8）去除上層正已烷，取50μl下層液用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)為2

5.3.2 蜂蜜、組織、腸衣、肝臟樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中，加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；

2）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”

5.3.3 熟食樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于50ml離心管中，加入4.5ml甲醇和0.5ml去離子水，振蕩2min，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，去除全部液體；

2）加入5ml乙氰和5ml正己烷，振蕩2min，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，去除全部液體；

3）加0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；

    注：熟食的添加回收試驗請在此步加入高標準。

4）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前需：將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干。

6.6 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.7終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)終止反應(yīng)后在10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0ppb）的吸光度值，再乘以*，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算