當(dāng)培養(yǎng)吼或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞形成致密的單層時(shí)，應(yīng)進(jìn)行傳代，否則對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。步驟如下：
1．洗滌細(xì)胞PBS洗滌細(xì)胞2次。
2．消化細(xì)胞加入O．05％*溶液1ml消化單層細(xì)胞，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞立即變圓、收縮。棄去*，利用培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘余*進(jìn)行消化。當(dāng)觀察到大部分細(xì)胞脫落或漂浮起來(lái)時(shí)加入培養(yǎng)液，終止*的消化作用。
3．培養(yǎng)細(xì)胞用滴管吹打壁上的細(xì)胞，使其*脫離和分離。按l：2的比例接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。
一、結(jié)果分析
通過(guò)培養(yǎng)可獲得生長(zhǎng)良好的內(nèi)皮細(xì)胞，可用下述方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。
1．光鏡觀察倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞呈菱形或多角形，融合成片后可形成鵝卵石狀鑲嵌排列。
2．電鏡觀察剛貼壁的內(nèi)皮細(xì)胞呈長(zhǎng)多角形，并向四周伸向細(xì)長(zhǎng)的突起，融合成片后細(xì)胞呈多角形。細(xì)胞表面有微絨毛，也有的細(xì)胞質(zhì)膜凹陷。胞核呈橢圓形，個(gè)別稍凹陷·核仁明顯。細(xì)胞之間具有間隙，伸出突起相連。位于邊緣的細(xì)胞呈收縮狀態(tài)，胞體*微絨毛收縮成小泡狀。
3．因子Ⅷ相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè) 由于因子Ⅷ只存在于內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板中，故因子Ⅷ相關(guān)抗原是鑒定體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞zui可靠的標(biāo)志。操作步驟如下：
(1)固定內(nèi)皮細(xì)胞：內(nèi)皮細(xì)胞用PBS沖洗干凈，放人乙醇一丙酮混合液(1：1)中固定10min，在空氣中自然干燥。
(2)加入抗體：加入因子Ⅷ相關(guān)抗原抗血清(如兔抗人因子Ⅷ相關(guān)抗原抗血清)，37℃孵育lh。用PBS沖洗干凈，晾干，再加抗*動(dòng)物IgG熒光抗體(如羊抗兔IgG熒光抗體)，37℃孵育30min。PBS沖洗，晾干。
(3)封片：用緩沖甘油封片。
(4)觀察：將片子置熒光顯微鏡下觀察，內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)呈較強(qiáng)的黃綠色熒光，胞核周圍尤其明顯。
二、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
(一)細(xì)胞凍存
內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)到一定數(shù)量時(shí)可用液氮凍存?zhèn)溆?。步驟如下：
1．洗滌細(xì)胞 在*消化下來(lái)的細(xì)胞中加入少量培養(yǎng)液，離心(1000r／min，10min)，吸去上清液。
2．凍存細(xì)胞向洗滌過(guò)的細(xì)胞內(nèi)加入凍存液(含10％DMSO的培養(yǎng)液)，使細(xì)胞濃度約為l×106／ml。將其分裝于細(xì)胞凍存管中，每管1ml。把凍存管放至70℃冰箱中過(guò)夜，再將凍存管放入液氮中凍存。
(二)細(xì)胞復(fù)蘇
1．融化凍存的細(xì)胞從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中并不斷振搖，使其快速融化：
2．洗滌細(xì)胞將凍存管離心(1000r／min，10min)，吸去上清液，以去除DMSO。
3．培養(yǎng)細(xì)胞向凍存管內(nèi)加入1ml培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞沉淀以獲得細(xì)胞懸液，移人培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再加入．4ml培養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度為3×lO5／ml。
