一、常見(jiàn)突變株的篩選

   從自然界分離的微生物，稱為野生型菌株。這類(lèi)菌株因能合成各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又稱為原養(yǎng)型菌株。野生型菌株由于人工誘變或自發(fā)突變而失去合成某種營(yíng)養(yǎng)的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺的營(yíng)養(yǎng)因子才能生長(zhǎng)，這類(lèi)突變株稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出是通過(guò)一系列培養(yǎng)基來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

    基本培養(yǎng)基(minimal medium，MM)：營(yíng)養(yǎng)貧乏，氮源由無(wú)機(jī)物組成，不含氨基酸、維生素、核酸堿基等有機(jī)物，只能維持野生型菌株正常生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能生長(zhǎng)，補(bǔ)充培養(yǎng)基(supplerrlentary medium，SM)：在基本培養(yǎng)基中加入某一缺陷型菌株不能合成的營(yíng)養(yǎng)因子，只能滿足該缺陷型菌株和野生型菌株的生長(zhǎng)。

    *培養(yǎng)基(cIDmplete medium，MM)：營(yíng)養(yǎng)豐富、全面，碳源、氮源都是一些有機(jī)物，能滿足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)。

(1)誘變和營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的富集誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變劑有亞硝基胍、紫外線、亞硝酸等，其中亞硝基胍誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的頻率*，一般可達(dá)10％以上，zui高達(dá)80％。在誘變后的存活菌體中營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的數(shù)量很少．大部分為野生型菌株．因此，要采取一些措施，淘汰野生型菌株，富集營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，以提高營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出效率。常采用以下幾種富集方法。

①抗生素法抗生素法常用于細(xì)菌和酵母菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型富集，前者用*，后者用*。將誘變處理后的菌懸液分離到加有抗生素的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后野生型細(xì)胞由于正常生長(zhǎng)繁殖而被殺死，營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞由于不能生長(zhǎng)繁殖而被保留下來(lái)，從而得到富集。

②菌絲過(guò)濾法真菌和放線菌等絲狀菌，其野生型孢子在MM培養(yǎng)基上能萌發(fā)長(zhǎng)成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子分離到基本培養(yǎng)基上，振蕩培養(yǎng)后，用滅菌的脫脂棉或?yàn)V紙過(guò)濾，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3～4h過(guò)濾一次，重復(fù)3～4次，然后稀釋涂平皿分離。

③高溫殺菌法利用芽胞菌類(lèi)的芽胞和營(yíng)養(yǎng)體對(duì)熱敏感性的差異，讓誘變后的細(xì)菌形成芽胞，然后把處于芽胞階段的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)液中培養(yǎng)，野生型芽胞萌發(fā)，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型芽胞則不能萌發(fā)。此時(shí)將培養(yǎng)物加熱到80℃處理一定時(shí)間，野生型細(xì)胞大部分被殺死，而缺陷型則得以保留。

(2)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出 經(jīng)過(guò)誘變和富集后的微生物群體中營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的數(shù)量雖然已較多，但仍然是多種微生物的混合體，因此，要把營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株從群體中檢出來(lái)。常采用以下幾種檢出方法。

①點(diǎn)植對(duì)照檢測(cè)法誘變后的孢子或菌體，經(jīng)富集培養(yǎng)后涂布到cM平板上，將培養(yǎng)成熟的菌落用接種針一個(gè)一個(gè)分別接種到MM和CM平板上的相應(yīng)位置培養(yǎng)。如果在MM上不生長(zhǎng)而在CM上生長(zhǎng)的菌落，即為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。挑取孢子或菌體分別接種到MM和CM斜面上進(jìn)一步驗(yàn)證。該法可靠性強(qiáng)，但工作量很大。

②影印法 經(jīng)富集后的孢子或菌體分離到CM上，待菌落培養(yǎng)成熟后(母皿)，采用滅菌過(guò)的特制絲絨印模，在母皿的菌落上輕輕一印，再轉(zhuǎn)印到方位相同的另一基本培養(yǎng)基和*培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。凡是在MM上不生長(zhǎng)而在CM上生長(zhǎng)的菌落，分別移接到MM和CM斜面上進(jìn)一步驗(yàn)證。

③夾層法 也稱延遲補(bǔ)給法。先在培養(yǎng)皿底部倒人一層MM，凝固后倒入含菌體細(xì)胞的MM，凝固后繼續(xù)加入第三層MM。經(jīng)富集后的孢子或菌體分離到此平板上，培養(yǎng)后平板上長(zhǎng)出的菌落，為野生型菌落，在平皿底部做好標(biāo)記。接著加上一層CM，繼續(xù)培養(yǎng)。如在MM上不生長(zhǎng)而在CM上生長(zhǎng)的小菌落，可能是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。進(jìn)一步用點(diǎn)植法復(fù)證。該法操作簡(jiǎn)便，但可靠性差。在CM
上生長(zhǎng)的小苗落m右可能縣畢長(zhǎng)能力弱的畢長(zhǎng)緩慢的原養(yǎng)型菌落。

④*補(bǔ)充法 該法有兩種情況．如果試驗(yàn)?zāi)康膬H僅是檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型，那么可以將富集培養(yǎng)后的細(xì)胞接種到含O．01％蛋白胨的MM上，培養(yǎng)后野生型細(xì)胞迅速地長(zhǎng)成大菌落，而生長(zhǎng)緩慢的小菌落可能是營(yíng)養(yǎng)缺陷型，此方法稱為*培養(yǎng)。如果試驗(yàn)的目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在MM中加入單一的氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)，此方法稱為補(bǔ)充培養(yǎng)。以上幾種營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選方法總結(jié)如。