兔神經(jīng)肽Y（NPY）ELISA試劑盒原理分析
　　
　　本試劑僅供研究使用
　　
　　試驗原理：
　　
　　兔神經(jīng)肽NPY試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知NPY濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將NPY和*標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中NPY的濃度呈比例關系。
　　
　　兔神經(jīng)肽NPY試劑盒內(nèi)容及其配制：
　　
　　試劑盒成份96孔配置48孔配置
　　
　　96/48人份酶標板1塊板（96T）半塊板（48T）
　　
　　塑料膜板蓋1塊半塊
　　
　　標準品：1000pg/ml1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）
　　
　　空白對照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）
　　
　　標準品稀釋緩沖液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）
　　
　　*標記的抗NPY抗體1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）
　　
　　親和鏈酶素-HRP1瓶（12ml）1瓶（5ml）
　　
　　洗滌緩沖液1瓶（20ml）1瓶（10ml）
　　
　　底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）
　　
　　底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）
　　
　　終止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）
　　
　　自備材料：
　　
　　1.蒸餾水。
　　
　　2.加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
　　
　　3.振蕩器及磁力攪拌器等。
　　
　　兔神經(jīng)肽NPY樣品收集、處理及保存方法：
　　
　　1、血清……操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細胞迅速小心地分離。
　　
　　2、血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
　　
　　3、細胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
　　
　　4、組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。
　　
　　5、保存……如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
　　
　　操作注意事項：
　　
　　●兔神經(jīng)肽NPY試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
　　
　　●實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
　　
　　●不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
　　
　　●使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
　　
　　●使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
　　
　　●底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
　　
　　●加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
　　
　　●按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
　　
　　安全性：
　　
　　1.兔神經(jīng)肽NPY避免直接接觸終止液和底物A、B，一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
　　
　　2.實難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
　　
　　3.不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
　　
　　試劑的準備：
　　
　　1.標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
　　
　　1000
　　
　　pg/ml（6號標準品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
　　
　　500
　　
　　pg/ml（5號標準品）100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
　　
　　250
　　
　　pg/ml（4號標準品）100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
　　
　　125
　　
　　pg/ml（3號標準品）100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
　　
　　62.5
　　
　　pg/ml（2號標準品）100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
　　
　　31.5
　　
　　pg/ml（1號標準品）100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
　　
　　0
　　
　　pg/ml（空白對照）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
　　
　　2.洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
　　
　　兔神經(jīng)肽NPY試劑盒性能：
　　
　　1.靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990。
　　
　　2.特異性：不與其它細胞因子反應。
　　
　　3.重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
　　
　　操作步驟：
　　
　　1.使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
　　
　　2.根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
　　
　　3.加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的*標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
　　
　　4.甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
　　
　　5.每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
　　
　　6.甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
　　
　　7.兔神經(jīng)肽NPY每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
　　
　　8.取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
　　
　　9.在450nm波長處測定各孔的OD值。
　　
　　結果判斷與分析：
　　
　　1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
　　
　　2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的NPY標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的NPY含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
　　
　　3、檢測值范圍：0-1000pg/ml
　　
　　4、敏感度：3.9pg/ml