細(xì)胞胱硫醚-γ-裂解酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；CGL）活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在運(yùn)用胱硫醚作為底物，在裂解酶的催化下，產(chǎn)生半，使用Ellman試劑后，呈現(xiàn)黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用光度法來測(cè)定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液或純化酶樣品胱硫醚-γ-裂解的活性檢測(cè)，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；CGL；EC4.4.1.1），又稱為胱硫醚酶（cystathionase），是轉(zhuǎn)硫化（transsulfuration）通路中的關(guān)鍵酶之一。在細(xì)菌、真菌和植物中，為正向（forward）轉(zhuǎn)硫化，而在哺乳動(dòng)物、真菌和某些細(xì)菌為逆向（reverse）轉(zhuǎn)硫化，構(gòu)成含硫氨基酸半（cysteine）和蛋氨酸（methionine）的相互轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)高半濃度和半合成，并參與合成。胱硫醚-γ-裂解酶為輔基5-磷酸吡哆醛（pyridoxal-5-phosphate；PLP）依賴性酶，催化胱硫醚（cystathionine）降解為半、2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）和氨；并具有催化高（homoserine）消去反應(yīng)（elimination reaction），產(chǎn)生2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）、氨和水；催化（cystine）消去反應(yīng)，產(chǎn)生硫化半（thiocysteine）丙酮酸和氨；催化半的消去反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸、硫化氫和氨。胱硫醚-γ-裂解酶參與硫化氫代謝通路（第三種氣體性傳導(dǎo)介質(zhì)gasotransmitter）調(diào)節(jié)，與血管松弛、炎性反應(yīng)、凋亡、缺血再灌注、氧化應(yīng)激等有關(guān)。人體胱硫醚-γ-裂解酶異常，會(huì)導(dǎo)致胱硫醚尿癥（cystathioninuria）、病（cystinosis）、惡性淋巴細(xì)胞病變等疾病，對(duì)于酒精性肝損傷敏感。基于底物胱硫醚，在胱硫醚-γ-裂解酶的催化下，產(chǎn)生半、2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）和氨，進(jìn)而半側(cè)鏈巰基與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來定量分析胱硫醚-γ-裂解酶的活性。胱硫醚-γ-裂解酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

反應(yīng)液（Reagent D）        微升

底物液（Reagent E）        毫升

陰性液（Reagent F）          微升

顯色液（Reagent G）         微升

產(chǎn)品說明書              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和顯色液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（Reagent G）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管 

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，并置零

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和顯色液（Reagent G）避免光照

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 樣品背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升底物液（Reagent E）

3． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

4． 加入20微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在37℃溫度下孵育30分鐘

7． 加入xx微升顯色液（Reagent G），混勻

8． 在37℃溫度下孵育5分鐘

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品背景對(duì)照 

四、 樣品活性測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 加入20微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在37℃溫度下孵育30分鐘

7． 加入xx微升顯色液（Reagent G），混勻

8． 在37℃溫度下孵育5分鐘

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù) 

五、計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景對(duì)照和樣品活性

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔里

3． 加入xx微升陰性液（Reagent E）到樣品背景對(duì)照孔里

4． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）到樣品活性孔里

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）到所有孔里

6． 分別加入20微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）

7． 輕輕搖動(dòng)96孔板

8． 在37℃溫度下孵育30分鐘

9． 分別加入xx微升顯色液（Reagent G）到所有孔里

10． 輕輕搖動(dòng)96孔板

11． 在37℃溫度下孵育5分鐘

12． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得背景和樣品活性讀數(shù)

13． 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要

5． 測(cè)定值由低到高變化

6． 光度測(cè)定后，比色皿須清洗

7． 反應(yīng)時(shí)間持續(xù)30分鐘

8． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

9． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

10． 可以使用胱硫醚-γ-裂解酶抑制劑DL-炔丙基（DL-Propargylglycine）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

11． 胱硫醚-γ-裂解酶單位活性定義為：在37℃，pH 8.2條件下，每分鐘內(nèi)產(chǎn)生1微摩爾半所需的酶量作為一個(gè)活性單位

12． 本公司提供系列轉(zhuǎn)硫化（transsulfuration）通路分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感