HL50607.2 v.A

組織γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

組織γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針NMA供體和DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物，在γ分泌酶的水解作用下，釋放出強(qiáng)烈熒光的NMA，而發(fā)生熒光峰值的變化，即采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中γ分泌酶活性的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

技術(shù)背景

γ分泌酶（γ-SECRETASE；EC3.4.24.81），是一種多亞體蛋白酶復(fù)合物（multisubunit protease complex），由4種蛋白組成：早老素蛋白（Presenilin；PS）、呆蛋白（nicastrin）、前咽缺陷蛋白-1（anterior pharynx defective 1；APH1）和早老素增強(qiáng)蛋白2（presenilin enhancer 2）。其為整合性跨膜蛋白，在早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里組裝和成熟，后期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行目標(biāo)蛋白切離。γ分泌酶切離由β分泌酶切離淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein；APP）產(chǎn)生C99和α分泌酶切離的C83片段，前者成為具有神經(jīng)毒性的40至42氨基酸長的淀粉樣β-多肽（amyloid-β peptide；Aβ）， 是阿茨罕默疾?。?/span>alzheimer disease；AD）的病理變化（淀粉樣斑；amyloid plaque）的主要成分，由此γ分泌酶成為阿茨罕默疾病治療的抗淀粉樣多肽藥物靶標(biāo)。γ分泌酶與NOTCH調(diào)節(jié)有關(guān)。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val（源于淀粉樣淀粉樣β-多肽前體蛋白序列708-715），通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長的供體（donor）到覆蓋供體波長的受體（acceptor），使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅（quench），使用2個熒光探針N-甲基氨茴酰NMA（N-Methyl-anthraniloyl）供體和二硝基苯基DNP（2,4-Dinitrophenyl）受體作為FRET對，來標(biāo)記的γ分泌酶選擇性多肽底物的兩端，在γ分泌酶的水解作用下，在丙氨酰（alaninyl）和蘇氨酰（threoninyl）殘基處切離，釋放出強(qiáng)烈熒光的NMA，在熒光分光光度儀下（激發(fā)波長340-360nm，散發(fā)波長440-450nm），來定量測定γ分泌酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

緩沖液（Reagent C）         毫升

底物液（Reagent D）         微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）              微升

產(chǎn)品說明書                1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

γ分泌酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入到一個液氮凍存管

5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

7． 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管

8． 加入預(yù)冷的xx微升裂解液（Reagent B） 

9． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>）

12． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

15． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如組織裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長355nm，散發(fā)波長440nm，增益倍數(shù)100至200，間隔10分鐘，讀數(shù)7次（共60分鐘） 

3． 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管

4． 加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1號管

5． 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到2至5號管

6． 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號管，混勻