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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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組蛋白脫乙?;?(HDAC2)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

時(shí)間:2023/2/22閱讀:823
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HL50082.3 v.A

 

組蛋白脫乙酰化酶2HDAC2)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

 

主要用途

 

組蛋白脫乙?;?/span>2HDAC2)活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)比色探針對(duì)硝基苯胺標(biāo)記乙?;嚯牡孜?,在特異性抑制劑的存在下,經(jīng)過(guò)HDAC脫乙酰基后,被位點(diǎn)特異性氨基肽酶水解,釋放黃色對(duì)硝基苯胺,即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的其適用于各種細(xì)胞、組織裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)、核蛋白樣品、部分或純化酶樣品中HDAC2的特異活性定量檢測(cè),以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

人體組蛋白脫乙?;福?/span>histone deacetylase;HDAC)家屬分成三類(lèi)共20多個(gè)蛋白:種類(lèi)Iclass I)與酵母Rpd3蛋白同源,包括HDAC12、3、8,存在于細(xì)胞核中;種類(lèi)IIclass II)與酵母Hda1蛋白同源,包括HDAC45、6、7、9a9b10HDRP/MITR,存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里;上述兩大種類(lèi)的蛋白分子催化結(jié)構(gòu)域含有鋅,且曲古菌素Atrichostatin A;TSA)敏感。種類(lèi)IIIclass III)為NAD輔助因子必需,又稱(chēng)為sirtuins,與酵母Sir2同源,包括SIRT17等。其曲古菌素Atrichostatin A;TSA)不敏感。通過(guò)催化組蛋白上賴(lài)氨酸殘基ε氨基酸的乙酰基團(tuán)的水解脫離,改變核小體(nucleosome)結(jié)構(gòu)達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和分化,一旦失控,則會(huì)導(dǎo)致腫瘤和衰老。HDAC2EC3.5.1.98),與各種不同蛋白,包括YY1,形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物,達(dá)到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期進(jìn)程、以及發(fā)育變化等控制作用。其脫乙?;繕?biāo)序列為 XXXLysAcX。基于乙?;嚯木哂锌拱被拿盖须x的功能,首先通過(guò)比色染料對(duì)硝基苯胺(p-Nitroanilinep-NA)來(lái)標(biāo)記乙?;嚯牡孜?,其次,在特異性抑制劑apicidin的差異濃度作用下,進(jìn)行HDAC的脫乙?;?,最后底物進(jìn)一步在氨基肽酶的催化酶解,釋放出具有強(qiáng)烈吸光值的黃色對(duì)硝基苯胺(波長(zhǎng)405nm),由此來(lái)定量測(cè)定組蛋白脫乙?;?/span>2特異活性。反應(yīng)系統(tǒng)為:

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液(Reagent A                      毫升

底物液(Reagent B                      微升

終止液(Reagent C                      微升

酶解液(Reagent D                      微升

補(bǔ)充液(Reagent E                      微升

專(zhuān)性液(Reagent F                      微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)              1

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里,底物液(Reagent B)避免光照,有效保證6

 

用戶自備

 

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于細(xì)胞預(yù)處理

培養(yǎng)箱:用于反應(yīng)物孵育

酶標(biāo)板或比色皿:用于反應(yīng)和比色的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀:用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

一、 測(cè)定準(zhǔn)備

 

1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如核蛋白或純化酶樣品等),置于冰槽里

2. 設(shè)定好酶標(biāo)儀或分光光度儀(溫度為37℃): 波長(zhǎng)405nm,并置零

 

二、活性測(cè)定

 

1) 總活性測(cè)定

 

1. 96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景空對(duì)照和待測(cè)樣品總活性

2. 分別移取xx微升緩沖液(Reagent A到相應(yīng)孔中

3. 分別加入xx微升底物液(Reagent B

4. 分別加入xx微升補(bǔ)充液(Reagent E或待測(cè)樣品(50微克核蛋白或200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白)(注意:樣品須清澈

5. 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30

6. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里,孵育60分鐘,避免光照

7. 分別加入xx微升終止液(Reagent C

8. 分別加入xx微升酶解液(Reagent D

9. 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30

10. 37℃培養(yǎng)箱里,孵育30分鐘

11. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿,在分光光度儀里檢測(cè):獲得吸光讀數(shù)

 

2) 非特異活性測(cè)定

 

1. 96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:待測(cè)樣品非特異活性

2. 移取xx微升緩沖液(Reagent A到相應(yīng)孔中

3. 加入xx微升專(zhuān)性液(Reagent F

4. 加入20微升待測(cè)樣品(50微克核蛋白或200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白)(注意:樣品須清澈

5. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里,孵育10分鐘,避免光照

6. 加入xx微升底物液(Reagent B

7. 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30

8. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里,孵育60分鐘,避免光照

9. 加入xx微升終止液(Reagent C

10. 加入xx微升酶解液(Reagent D

11. 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30

12. 37℃培養(yǎng)箱里,孵育30分鐘

13. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿,在分光光度儀里檢測(cè):獲得吸光讀數(shù)

 

3) 樣品活性計(jì)算

 

 

  3)樣品特異活性

 

樣品總活性-樣品非特異活性=樣品特異活性

 

注意事項(xiàng)

 

1. 本產(chǎn)品為20次操作,包括背景對(duì)照

2. 操作時(shí),須戴手套

3. 系統(tǒng)操作過(guò)程中,背景測(cè)定只需1

4. 樣品須澄清,至關(guān)重要

5. 樣品處理時(shí),避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺(alkyl amine)等

6. 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定

7. 濾波器可以使用波長(zhǎng)400nm替代405nm

8. 測(cè)定值由低到高變化;測(cè)定可以持續(xù)60分鐘

9. 測(cè)定值吸光讀數(shù)越高,表明酶活性越高

10. 比色測(cè)定后,比色皿須清洗

11. 待測(cè)樣本為核蛋白樣品,其蛋白濃度為50微克/20微升;待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液,其蛋白濃度為200微克/20微升(本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒HL30030.1

12. 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調(diào)整樣品濃度

13. 組蛋白脫乙?;?/span>2單位活性定義為:在37℃pH 8.0條件下,每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾對(duì)硝基所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14. 本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

 

 


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