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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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DNase I 溶液 說(shuō)明書(shū)

時(shí)間:2023/4/14閱讀:769
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介

DNase I ,   即 Deoxyribonuclease I    即脫氧核糖核酸酶 I , 是一種可以消化單鏈或雙鏈 DNA 產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNase I 水解單鏈或雙  DNA 后的產(chǎn)物, 5'端為磷酸基團(tuán),3'端為羥基。

DNase I 性依賴(lài)于鈣離子,   并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活 。鎂離子存在條件下, DNase I 可隨機(jī)剪切雙鏈 DNA 的任意位點(diǎn);二價(jià)錳離子存在條件下,DNase I  可在同一位點(diǎn) 剪切 DNA 雙鏈,成平末端, 1 -2 個(gè)核苷酸突出的粘末端。

特點(diǎn): RNase (RNase free), 可以用于各種 RNA 樣品的處理 。提供了用于 DNase I 失活所需的 EDTA。

用途:制備不含 DNA  RNA 樣品;RT -PCR 反應(yīng)前 RNA 樣品中去除基因組 DNA   DNA 污染;體外 T7, T3, SP6 等 RNA Polymerases 催化的 RNA 轉(zhuǎn)錄后去除 DNA 模板; DNase I footprinting 研究 DNA -蛋白質(zhì)相互作用; 缺口平移(nicktranslatioin);  產(chǎn)生 DNA  機(jī)片段文庫(kù); 細(xì)胞凋亡 TUNEL 檢測(cè)中部分剪切基因組 DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照。

來(lái)源:從牛胰腺純化得到 。分子量:  32kDa(單體)。

活性定義:37°C 10 分鐘內(nèi),將能夠降解 1 μg pBR322 質(zhì)粒 DNA 所需的酶量定義為 1 個(gè)活性單位。

活性檢測(cè)條件:40mM Tris -HCl (pH8.0) , 10mM MgSO4, 1mM CaCl2 , 1 μg of pBR322 DNA 度:不含其它 DNA 內(nèi)切酶和外切酶,不含 RNA 酶。

保存條件

-20°C 保存, 一年內(nèi)有效。

操作流程

1 RT -PCR 反應(yīng)前 RNA 樣品中 DNA 的去除:

1.1 DNA 模板限制性核酸內(nèi)切酶作用后線(xiàn)性化。酚/氯仿和氯仿/異丙醇提取 DNA,用乙醇沉 淀后, 溶于適量的無(wú)菌去離子水中。

1.2  向一無(wú) RNA 酶的 EP 管中依次加入下列試劑:

RNA

1 μg

應(yīng)緩沖液(10×)

1 μl

 


 

 

補(bǔ)充經(jīng) DEPC 處理的去離子水

 9 μl

DNase I (1Ul)

1 μl

注意:如需處理較大量的 RNA 樣品, 可以按照比例放大上述反應(yīng)體系 。如果能在上述反應(yīng) 體系中加入適量 Ribonuclease inhibitor 以防止 RNA 降解則更佳。

1.3 37°C 孵育 30min。

1.4  向上述反應(yīng)體系中加入 1 μl 25mM EDTA,65°C 孵育 10min,   以失活 DNase I 。注意:在 沒(méi)有合劑如 EDTA 等存在情況下加熱, RNA 可被水解。

1.5  上述加熱處理過(guò)的 RNA 樣品即可直接用于處理好的 RNA 可用作 RT -PCR 反應(yīng)的模板。

2 體外 RNA 反轉(zhuǎn)錄后模板 DNA 的去除:

2.1  在每含有 0.5 μg  DNA 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入 1U DNase I 。注意:在某些情況下,  DNA消化所需的 DNase I 的量需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。

2.2 37°C  孵育 15min。

2.3  酚/氯仿抽提失活 DNase I

3  缺口平移進(jìn)行 DNA 標(biāo)記

3.1  參考如下表格設(shè)置反應(yīng):

Reaction Buffer (10×) for DNA Polymerase I

2.5 μl

3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP) *

1.25μl

[α -32P]-dNTP, ~110TBq/mmol (3000Ci/mmol)

1.85 -3.7MBq (50 -100μ Ci)

DNase I (freshly diluted to 0.002Ul)**

1 μl

DNA Polymerase I, E.coli

0. 5 -1.5 μl (5 -15U)

Template DNA

0.25μg

補(bǔ)充無(wú)核酸酶去離子水

 25μl

* 3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP):分別取除已經(jīng)標(biāo)記的 dNTP 外的 3  dNTP(100mM)  各 1 μl  加入到 97μl  的無(wú)核酸酶的去離子水中混勻即可 。例如標(biāo)記的為 dATP,則需混合 dTTP、dCTP  dGTP 三種 dNTP 至每種的最終濃度為 1mM。配好的 dNTP 可存放于 -20°C 以備后續(xù)使用。

** DNase I 可以用 1 ×  Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進(jìn)行稀釋。

Reaction Buffer (10 ×) for DNA Polymerase I    500mM Tris -HCl (pH7.5 at 25°C) ,   100mM MgCl2 , 10mM DTT。

3.2  立即 15°C 孵育 15~60min。

3.3  上述反應(yīng)體系中加入l 0.5M EDTA(pH 8.0)終止反應(yīng)。

3.4  從中取出少量例如 1 μl 檢測(cè)標(biāo)記效率 。通常標(biāo)記效率至少可以達(dá)到 108cpmg DNA。

3.5  可用 Sephadex G -50 或 Bio -Gel P -60 去除[α -32P]-dNTP   以純化獲得標(biāo)記的 DNA

馨提示:

了您的自身安全,使用試劑前,請(qǐng)做好防護(hù),如穿實(shí)驗(yàn)服, 帶手套等。


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