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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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細(xì)菌糖類總量硫酸-比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

時(shí)間:2024/8/1閱讀:1193
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主要用途

 

細(xì)菌糖類總量硫酸-比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)硫酸處理后,水解產(chǎn)生單糖,與反應(yīng),生成黃色產(chǎn)物,即采用比色法測(cè)算糖類總量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)菌細(xì)胞樣品中糖類總量檢測(cè)。產(chǎn)品即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

糖類(saccharide),又稱為碳水化合物(carbohydrate),其分成四類:?jiǎn)翁牵╩onosaccharide;例如葡萄糖)、二糖(disaccharide;例如蔗糖)、寡糖(oligosaccharide;棉籽糖)和多糖(polysaccharide;例如淀粉和糖原)。糖類構(gòu)成輔酶和核酸,以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要元素,在能量?jī)?chǔ)存、免疫功能、授精、預(yù)防病理變化、血液凝結(jié)、發(fā)育等方面具有重要作用。使用濃硫酸,將復(fù)雜性多糖水解成單糖,脫水產(chǎn)生反應(yīng)性中間產(chǎn)物,與反應(yīng),生成黃色產(chǎn)物,在分光光度儀(492nm 波長(zhǎng))下出現(xiàn)吸光峰值的變化,來(lái)定量測(cè)定樣品中糖類量的總含量。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

稀釋液(Reagent A          5毫升

反應(yīng)液(Reagent B         5毫升

酸性液(Reagent C         25毫升

標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent D         500微升

裂解液(Reagent E         10毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)               1

 

保存方式

 

保存在4冰箱里;酸性液(Reagent C具有腐蝕性,注意操作安全;反應(yīng)液(Reagent B)避免光照;有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和反應(yīng)的容器

干式恒溫儀或恒溫水槽:用于反應(yīng)孵育

超聲儀:用于裂解細(xì)菌細(xì)胞

比色皿:用于比色的容器

分光光度儀:用于比色分析 

 

實(shí)驗(yàn)步驟

一、樣品準(zhǔn)備 

1.準(zhǔn)備好10毫升待測(cè)的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí),速度為220RPM

2.直至OD6000.40.8,即12 X 107細(xì)胞/毫升

3.置于冰槽里5分鐘

4.放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為1000g

5.小心抽去上清液

6.加入500微升裂解液(Reagent E,充分混勻

7.轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8.強(qiáng)力渦旋震蕩15

9.置于超聲儀下:200瓦,50%功率,10秒一次,重復(fù)3次

10.冰槽里靜置15分鐘

11.放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

12.小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

13.移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1

14.即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

1.準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管,標(biāo)記為15號(hào)管

2.分別加入200微升稀釋液(Reagent A到每個(gè)離心管

3.移取200微升標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent D1號(hào)管,混勻

4.小心移取200微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent D2號(hào)管,混勻

5.小心移取200微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent D3號(hào)管,混勻

6.小心移取200微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent D4號(hào)管,混勻

7.將15號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用,避免光照;標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

 

 

管號(hào)

 標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent D)

稀釋液(Reagent A)

測(cè)定體系中標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖含量

1

200微升

200微升

50微克

2

200微升1號(hào)管

200微升

25微克

3

200微升2號(hào)管

200微升

12.5微克

4

200微升3號(hào)管

200微升

6.125微克

5

——

200微升

0

 

三、樣品測(cè)定

1.設(shè)定好分光光度儀:波長(zhǎng)492nm,并置零

2.分別移取200微升反應(yīng)液(Reagent B)1.5毫升離心管

3.分別加入200微升上述制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測(cè)樣品,混勻

4.分別加入1毫升酸性液(Reagent C,混勻

5.在80℃干式恒溫儀孵育30分鐘(注意:如果復(fù)雜多糖無(wú)法充分水解,建議使用煮沸5至30分鐘處理)

6.室溫下冷卻10分鐘,避免光照

7.轉(zhuǎn)移到新的比色皿

8.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)(492nm波長(zhǎng)):獲得吸光讀數(shù)

9.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為吸光讀數(shù);橫座標(biāo)(X軸)為標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖含量微克

10.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)麥芽糖含量(微克)

11.計(jì)算樣品實(shí)際麥芽糖濃度(微克/毫升) 

 

【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)麥芽糖含量(微克)÷0.2(樣品容量:毫升)】×10(樣品稀釋倍數(shù))=微克/毫升

 

注意事項(xiàng)

 

1.本產(chǎn)品為25次操作,包括標(biāo)準(zhǔn)液

2.本產(chǎn)品適用于還原性、非還原性糖類、寡糖以及復(fù)雜性糖類,但不適合于氨基糖或脫氧糖及其衍生物

3.本產(chǎn)品檢測(cè)范圍為0.2至50微克糖類總量

4.本產(chǎn)品適用于96孔板操作,實(shí)際用量按比例減少

5.操作時(shí),須戴手套

6.酸性液(Reagent C具有腐蝕性,注意操作安全

7.孵育時(shí),避免光照

8.如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以稀釋樣品用量;注意在計(jì)算實(shí)際濃度時(shí),不要忘記稀釋倍數(shù)調(diào)整

9.糖類總量表述方式:微克麥芽糖/毫升;微克麥芽糖/細(xì)胞量;微克麥芽糖/總蛋白量

10.本公司提供系列糖類檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感 

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