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上海宸功生物技術(shù)有限公司
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植物查爾酮合成酶活性比色法定量檢測試劑盒

時間:2017/1/17閱讀:1604
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HL50713.1 v.A

 

植物查爾酮合成酶(chalcone synthase)活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

植物查爾酮合成酶(chalcone synthase)活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A縮合反應(yīng)系統(tǒng)中釋放出巰基輔酶A,使用Ellman試劑后,產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化,即采用比色法來測定植物裂解樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織,包括種子(seed)、葉片(leaf)、根(root)、胚胎葉(cotyledon)、上胚軸(epicotyl)等查爾酮合成酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

查爾酮合成酶(chalcone synthase;CHS;EC2.3.1.74是聚酮體合成酶(polyketide synthase;PKS)大家屬中的一員,是啟動類黃酮(flavonoid)化合物合成通路中*步關(guān)鍵酶,形成植物系統(tǒng)性獲得性抗性(systematic acquired resistance;SAR)的基礎(chǔ)。查爾酮合成酶存在于細菌、植物和真菌中。在所有裸子植物(gymnosperm)和被子植物(angiosperm)的各種不同發(fā)育階段中的不同組織中表達。查爾酮合成酶為同源二聚體,分子量為40至4000Kd,由環(huán)境壓力,包括UV照射、傷口、病原菌襲擊等誘導(dǎo),通過丙二酰輔酶A脫羧基反應(yīng)(decarboxylation)、與香豆酰輔酶縮合、聚酮體鏈延展(chain elongation)、中間產(chǎn)物環(huán)狀化(cyclization)和芳構(gòu)化(aromatization)產(chǎn)生查爾酮,一種類黃酮化合物前體,作為化學(xué)信使,由此生成各種后續(xù)繼發(fā)性代謝化合物,參與抗病原微生物例如異黃酮植物保護素(isoflavonoid phytoalexin)、花青素花色素化、抵御環(huán)境壓力(UV光保護)、花粉育性(pollen fertility)、抗氧化、共生根系結(jié)瘤(symbiotic root nodulation),以及作為抗生素、免疫抑制劑、抗腫瘤和抗真菌的藥物作用。還在細菌的囊腫形成和阿米巴細胞分化中產(chǎn)生作用。基于香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A,在敏感性抑制劑木犀草素Luteolin存在與否的情況下,受到查爾酮合成酶的作用,縮合產(chǎn)生查爾酮,并釋放出巰基輔A(CoA-SH),進而與Ellman試劑5,5-二硫基-2-硝基苯甲酸[5,5,-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid);DTNB]反應(yīng)后,產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acid;TNB),通過其吸收峰值的變化412nm波長),來定量分析查爾酮合成酶的活性。查爾酮合成酶反應(yīng)系統(tǒng)為:

 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液(Reagent A) 毫升

裂解液(Reagent B) 毫升

緩沖液(Reagent C) 毫升

反應(yīng)液(Reagent D) 毫升

底物液(Reagent E) 毫升

專性液(Reagent F) 微升

產(chǎn)品說明書 1份

 

保存方式

 

保存緩沖液(Reagent C)、反應(yīng)液(Reagent D)和底物液(Reagent E)在-20冰箱里;其余的保存在4冰箱里;反應(yīng)液(Reagent D)和底物液(Reagent E)避免光照;有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器:用于裂解組織細胞

微型臺式離心機:用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀:用于比色分析

 

實驗步驟

 

  • 樣品準備 

 

  • 準備好新鮮的植物組織(葉片、谷粒、種子等),并秤重以確定1克組織重量 
  • (選擇步驟)放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)加入xx毫升清理液(Reagent A清洗1
  • 即刻用刀片切碎組織
  • 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • 加入預(yù)冷的xx毫升裂解液(Reagent B)
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器,在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約80下)
  • 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管,放進4微型臺式離心機離心10分鐘,速度5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移出上清液(注意:不要觸碰沉淀物)到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)如果上清液含有肉眼可見的殘渣,重復(fù)離心5分鐘一次,速度5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)
  • 即刻移入到1.5毫升離心管
  • 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1
  • 放進-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

  • 測定準備

 

  • 開啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為30℃):波長412nm,間隔5分鐘,讀數(shù)7次(共30分鐘),并置零 
  • 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;反應(yīng)液(Reagent D底物液(Reagent E避免光照緩沖液(Reagent C室溫下預(yù)熱

 

  • 背景對照測定

 

  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升底物液(Reagent E
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入20微升待測樣品(200微克蛋白)(注意:樣品須清澈 
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照(30分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))

 

  • 樣品總活性測定

 

  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent D
  • 加入xx微升底物液(Reagent E
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入20微升待測樣品(200微克蛋白)(注意:樣品須清澈
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(shù)30分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù)) 

 

  • 樣品非特異活性測定

 

檢測開始前,分別移取xx微升專性液(Reagent F和待測樣品(注意:200微克蛋白到1.5毫升離心管,混勻后,放進30培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

 

  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent D
  • 加入xx微升底物液(Reagent E
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品 
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(shù)(30分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))

 

六、計算樣品活性

 

  • 樣品總活性和非特異活性計算

 

 

2)樣品特異活性計算

 

 

  • 酶標測定

 

1)樣品總活性測定

  • 96孔板上做好相應(yīng)標記:背景對照和待測樣品
  • 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C到96孔板的所有孔里
  • 加入xx微升緩沖液(Reagent C到背景對照孔里
  • 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent D到待測樣品孔里
  • 分別加入xx微升底物液(Reagent E到96孔板的所有孔里
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 分別加入20微升待測樣品(200微克蛋白)到96孔板的所有孔里(注意:樣品須清澈
  • 輕輕搖動96孔
  • 即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)數(shù)
  • 活性計算:

 

2)樣品非特異活性測定

 

檢測開始前,分別移取xx微升專性液(Reagent F和待測樣品(注意:200微克蛋白到1.5毫升離心管,混勻后,放進30培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

 

  • 96孔板上做好相應(yīng)標記:待測樣品
  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到96孔板的孔里
  • 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent D
  • 加入xx微升底物液(Reagent E
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品 
  • 輕輕搖動96孔
  • 即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)數(shù)
  • 活性計算:

 

  • 樣品特異活性計算

 

 

注意事項

 

  • 本產(chǎn)品為20次操作
  • 操作時,須戴手套
  • 建議使用比色皿測定
  • 樣品須澄清,至關(guān)重要 
  • 加樣后3秒內(nèi)比色測定
  • 測定值由低到高變化;測定可持續(xù)60分鐘
  • 比色測定后,比色皿須清洗*
  • 樣本測定30分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
  • 如果待測樣本為總蛋白,其蛋白濃度為200微克/20微升(本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1)
  • 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
  • 查爾酮合成酶單位活性定義為:在30℃,pH 7.8條件下,每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾輔酶A所需的酶量作為一個活性單位
  • 本公司提供系列聚酮體代謝檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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