HL50713.1 v.A

植物查爾酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

植物查爾酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A縮合反應(yīng)系統(tǒng)中釋放出巰基輔酶A，使用Ellman試劑后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定植物裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等查爾酮合成酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

查爾酮合成酶（chalcone synthase；CHS；EC2.3.1.74）是聚酮體合成酶（polyketide synthase；PKS）大家屬中的一員，是啟動類黃酮（flavonoid）化合物合成通路中*步關(guān)鍵酶，形成植物系統(tǒng)性獲得性抗性（systematic acquired resistance；SAR）的基礎(chǔ)。查爾酮合成酶存在于細(xì)菌、植物和真菌中。在所有裸子植物（gymnosperm）和被子植物（angiosperm）的各種不同發(fā)育階段中的不同組織中表達(dá)。查爾酮合成酶為同源二聚體，分子量為40至4000Kd，由環(huán)境壓力，包括UV照射、傷口、病原菌襲擊等誘導(dǎo)，通過丙二酰輔酶A脫羧基反應(yīng)（decarboxylation）、與香豆酰輔酶縮合、聚酮體鏈延展（chain elongation）、中間產(chǎn)物環(huán)狀化（cyclization）和芳構(gòu)化（aromatization）產(chǎn)生查爾酮，一種類黃酮化合物前體，作為化學(xué)信使，由此生成各種后續(xù)繼發(fā)性代謝化合物，參與抗病原微生物例如異黃酮植物保護(hù)素（isoflavonoid phytoalexin）、花青素花色素化、抵御環(huán)境壓力（UV光保護(hù)）、花粉育性（pollen fertility）、抗氧化、共生根系結(jié)瘤（symbiotic root nodulation），以及作為抗生素、免疫抑制劑、抗腫瘤和抗真菌的藥物作用。還在細(xì)菌的囊腫形成和阿米巴細(xì)胞分化中產(chǎn)生作用。基于香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A，在敏感性抑制劑木犀草素（Luteolin）存在與否的情況下，受到查爾酮合成酶的作用，縮合產(chǎn)生查爾酮，并釋放出巰基輔酶A（CoA-SH），進(jìn)而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5,-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析查爾酮合成酶的活性。查爾酮合成酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

反應(yīng)液（Reagent D） 毫升

底物液（Reagent E） 毫升

專性液（Reagent F） 微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準(zhǔn)備 

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測定準(zhǔn)備

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長412nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱

• 背景對照測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升待測樣品（200微克蛋白）（注意：樣品須清澈） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品總活性測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升待測樣品（200微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

• 樣品非特異活性測定

檢測開始前，分別移取xx微升專性液（Reagent F）和待測樣品（注意：200微克蛋白）到1.5毫升離心管，混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

六、計算樣品活性

• 樣品總活性和非特異活性計算

2）樣品特異活性計算

• 酶標(biāo)儀測定

1）樣品總活性測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和待測樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔里
• 加入xx微升緩沖液（Reagent C）到背景對照孔里
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）到待測樣品孔里
• 分別加入xx微升底物液（Reagent E）到96孔板的所有孔里
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入20微升待測樣品（200微克蛋白）到96孔板的所有孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)數(shù)
• 活性計算：

2）樣品非特異活性測定

檢測開始前，分別移取xx微升專性液（Reagent F）和待測樣品（注意：200微克蛋白）到1.5毫升離心管，混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品
• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的孔里
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品 
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)數(shù)
• 活性計算：

• 樣品特異活性計算

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)60分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定30分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 如果待測樣本為總蛋白，其蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 查爾酮合成酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾輔酶A所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列聚酮體代謝檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感