HL50414.3 v.A

純化高爾基體UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-galactosyl transferase）活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

純化高爾基體UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-galactosyl transferase）活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過底物UDP-半乳糖受到UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化后，獲得UDP，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物、人體細(xì)胞或組織分離純化的高爾基體裂解萃取液樣品、部分或*純化酶樣品中UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

尿苷二磷酸半乳糖轉(zhuǎn)移酶（uridine diphospogalactosyl transferase；beta4GalT ；EC2.4.1.90），全稱為尿苷二磷酸-α-D-半乳糖：N-乙酰-D-葡糖胺4-β-D-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-α-D-galactose:N-acetyl-D-glucosamine 4-β-D-galactosyl transferase），又稱為β-N-乙酰-D-葡糖胺酰糖肽β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（β-N-acetylglucosaminyl-glycopeptide β-1,4-galactosyltransferase；EC2.4.1.38）或N-乙酰乳糖胺合成酶（N-acetyllactosamine synthase；EC2.4.1.22），屬于糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase）家屬。UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶分成7種4組：1和2；3和4；5和6；以及7，為II型膜結(jié)合蛋白，位于高爾基體的反面潴泡（Trans Cisternae）上，成為高爾基體的標(biāo)志蛋白。其*底物為UDP-半乳糖。其功能在于轉(zhuǎn)移半乳糖以β1,4鏈接形式到類似糖受體上：N-乙酰糖胺（N-acetylglucosamine）和葡萄糖等，生成不同的結(jié)合糖（glycoconjugate）和二糖（乳糖），延長(zhǎng)糖蛋白和糖脂的糖鏈，進(jìn)行蛋白質(zhì)處理，而作用于細(xì)胞表面和免疫系統(tǒng)。一旦酶功能缺失，將導(dǎo)致先天性糖基化異常疾病（congenital disorder of glycosylation； CDG），出現(xiàn)精神運(yùn)動(dòng)性（psychomotor）異常癥狀和精神發(fā)育遲緩等。基于底物UDP-半乳糖和N-乙酰糖胺，在錳離子的存在下，受到UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶的催化，獲得產(chǎn)物UDP和N-乙酰乳糖胺（N-acetyllactoamine），進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）  毫升

酶促液（Reagent B）  微升

反應(yīng)液（Reagent C）  微升

底物液（Reagent D）  微升

陰性液（Reagent E）  微升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如純化高爾基體裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔2分鐘，讀數(shù)6次（共10分鐘），并置零
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent B）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘

• 樣品測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent B）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入10微升待測(cè)樣品（注意：20微克高爾基體裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘

• 計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)儀測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A）到96孔板里
• 分別加入xx微升酶促液（Reagent B）
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent D）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（20微克高爾基體裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和10分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘
• 光度測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于10分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為20微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列糖基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感