HL50259.4 v.A

細(xì)菌蘋果酸脫氫酶（MDH）活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)菌蘋果酸脫氫酶（MDH）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過蘋果酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法來測定細(xì)菌裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌細(xì)胞裂解樣品例如紫色光能利用細(xì)菌（Purple phototropic）、嗜冷性細(xì)菌（psychrophilic）、嗜鹽性細(xì)菌（halophilic）等蘋果酸脫氫酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase；MDH；EC1.1.1.37），又稱為蘋果酸NAD氧化還原酶（L-Malate:NAD⁺ oxidoreductase），是檸檬酸循環(huán)（citric acid cycle）中酶之一，為氧化還原酶，催化蘋果酸和草酰乙酸（oxaloacetate）的互相轉(zhuǎn)化反應(yīng)，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）作為輔因子。同時(shí)參與非糖物質(zhì)小分子轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃钱惿╣luconeogenesis）作用。蘋果酸脫氫酶存在于所有真核細(xì)胞中，有2種同工酶：線粒體型（M型）和胞漿型（S型），由2個(gè)相同的亞體構(gòu)成，每個(gè)亞體分子量為35KD。細(xì)菌蘋果酸脫氫酶分成兩類：小分子量和大分子量。前者為60至65Kd分子量，同源二聚體，包括大腸桿菌（E. Coli）、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌，與真核生物，尤其是線粒體型類同；后者為117至146Kd分子量，同源四聚體，包括桿菌（Bacillus）、嗜熱細(xì)菌（Thermoactinomyces）、古細(xì)菌（Archaebacteria）等。碘化物，例如甲狀腺素（Thyroxine）、碘（iodine）、等抑制蘋果酸脫氫酶活性；而磷酸鹽、砷酸鹽（arsenate）和鋅離子可以激活蘋果酸脫氫酶。基于草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶的催化下，逆轉(zhuǎn)化為蘋果酸，同時(shí)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光值的變化（340nm 波長），來定量測定蘋果酸脫氫酶的活性。蘋果酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

裂解液（Reagent A） 毫升

活性液（Reagent B）   微升

緩沖液（Reagent C） 毫升

反應(yīng)液（Reagent D）   毫升

底色液（Reagent E） 毫升

陰性液（Reagent F）   微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存活性液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，底色液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

超聲儀：用于裂解細(xì)菌細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于光度的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí)，速度為220RPM
• 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 加入xx微升活性液（Reagent B）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于超聲儀下超聲裂解處理：100瓦功率，20秒一次，間隔2分鐘，重復(fù)4次
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)菌裂解樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔30秒，讀數(shù)6次（共3分鐘），并置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照（0分鐘讀數(shù)－3分鐘讀數(shù)） 

• 樣品測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 加入20微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－3分鐘讀數(shù)） 

• 計(jì)算樣品活性

六、酶標(biāo)儀測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里 
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 分別加入xx微升底色液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測，包括（0分鐘讀數(shù)和3分鐘讀數(shù)）
• 活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)光度測定
• 反應(yīng)1分鐘后光度測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定可持續(xù)3分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 背景空對(duì)照0分鐘讀數(shù)通常0.2至0.8為理想狀態(tài)
• 背景空對(duì)照的正常讀數(shù)差值（0分鐘－3分鐘）通常為0.001至0.005（正負(fù)即可）
• 樣品0分鐘讀數(shù)通常和背景空對(duì)照0分鐘讀數(shù)一致
• 樣本測定3分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 蘋果酸脫氫酶（MDH）單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾草酰乙酸和NADH至蘋果酸和NAD所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列蘋果酸脫氫酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感