HL10118.3 v.A

細胞/組織高質純化溶酶體（lysosome）分離試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細胞/組織高質純化溶酶體（lysosome）分離試劑是一種旨在從動物細胞或組織中分離出活性完整而高度純化的溶酶體細胞器的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于動物軟組織（肝或腦組織）和培養(yǎng)細胞的溶酶體的制備。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度俱佳。

技術背景

溶酶體（lysosome）是一種普遍存在于真核細胞中的細胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各種細胞殘渣和廢棄物質，包括過多的或破損的其它細胞器、食物顆粒、吞噬的細菌和病毒等。其大小為0.5至1.5微米，球圓形，溶酶體內(nèi)pH為5.0左右。溶酶體功能異常會引起溶酶體貯積癥（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性癡呆?。?/span>Tay-sachs disease）和龐貝氏癥 （Pompe’s disease）。溶酶體細胞器的分離是現(xiàn)代細胞生物學研究的zui常用的手段之一。從任何組織或細胞分離溶酶體的技術方法基本上采用：*，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得溶酶體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的溶酶體。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   毫升

裂解液（Reagent B）   毫升

凈化液（Reagent C）   毫升

強化液（Reagent D）   毫升

分離液（Reagent E）   毫升

高純液A（Reagent F）   毫升

高純液B（Reagent G）   毫升

高純液C（Reagent H）   毫升

高純液D（Reagent I）   毫升

高純液E（Reagent J）   毫升

保存液（Reagent K）   毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

*細胞培養(yǎng)液（12052）：用于細胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃臺式離心機：用于沉淀細胞

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細胞

實驗步驟

• 動物軟組織溶酶體分離（組織勻漿法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移取xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 手術取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時）
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約60至80下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移取上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心移取5毫升上清液到新的15毫升離心管
• 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體粗提沉淀物
• 加入xx毫升分離液（Reagent E），混勻沉淀顆粒群
• 準備1個6毫升超速離心管
• 移取xx毫升高純液A（Reagent F）到6毫升超速離心管底部（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent F)）
• 輕輕加上xx毫升高純液B（Reagent G）在高純液A（Reagent F）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent G)）
• 輕輕加上xx毫升高純液C（Reagent H）在高純液B（Reagent G）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液C(Reagent H)）
• 輕輕加上xx毫升高純液D（Reagent I）在高純液C（Reagent H）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液D(Reagent I)）
• 輕輕加上xx毫升高純液E（Reagent J）在高純液D（Reagent I）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液E(Reagent J)）
• 輕輕加上xx毫升上述溶酶體混勻液在高純液E（Reagent J）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心120分鐘，速度為145000g
• 小心收集頂部溶酶體樣品帶到15毫升錐形離心管——此步驟獲得高純溶酶體樣品
• 加入xx毫升預冷的保存液（Reagent K）
• 放進4℃超速離心機再次離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

二、動物軟組織溶酶體分離（化學處理法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移取xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 手術取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時）
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預冷的強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入xx毫升預冷的保存液（Reagent K），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移取上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心移取10毫升上清液到新的15毫升離心管
• 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體粗提沉淀物
• 加入xx毫升分離液（Reagent E），混勻沉淀顆粒群
• 準備1個6毫升超速離心管
• 移取xx毫升高純液A（Reagent F）到6毫升超速離心管底部（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent F)）
• 輕輕加上xx毫升高純液B（Reagent G）在高純液A（Reagent F）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent G)）
• 輕輕加上xx1毫升高純液C（Reagent H）在高純液B（Reagent G）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液C(Reagent H)）
• 輕輕加上xx毫升高純液D（Reagent I）在高純液C（Reagent H）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液D(Reagent I)）
• 輕輕加上xx毫升高純液E（Reagent J）在高純液D（Reagent I）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液E(Reagent J)）
• 輕輕加上xx毫升上述溶酶體混勻液在高純液E（Reagent J）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心120分鐘，速度為145000g
• 小心收集頂部溶酶體樣品帶到15毫升錐形離心管——此步驟獲得高純溶酶體樣品
• 加入xx毫升預冷的保存液（Reagent K）
• 放進4℃超速離心機再次離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

三、動物細胞溶酶體分離（細胞勻漿法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移取xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養(yǎng)瓶的細胞（10⁸），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移取上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心移取5毫升上清液到新的15毫升離心管
• 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體粗提沉淀物
• 加入xx毫升分離液（Reagent E），混勻沉淀顆粒群
• 準備1個6毫升超速離心管
• 移取xx毫升高純液A（Reagent F）到6毫升超速離心管底部（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent F)）
• 輕輕加上xx毫升高純液B（Reagent G）在高純液A（Reagent F）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent G)）
• 輕輕加上xx毫升高純液C（Reagent H）在高純液B（Reagent G）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液C(Reagent H)）
• 輕輕加上xx毫升高純液D（Reagent I）在高純液C（Reagent H）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液D(Reagent I)）
• 輕輕加上xx毫升高純液E（Reagent J）在高純液D（Reagent I）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液E(Reagent J)）
• 輕輕加上xx毫升上述溶酶體混勻液在高純液E（Reagent J）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心120分鐘，速度為145000g
• 小心收集頂部溶酶體樣品帶到15毫升錐形離心管——此步驟獲得高純溶酶體樣品
• 加入xx毫升預冷的保存液（Reagent K）
• 放進4℃超速離心機再次離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

四、動物細胞溶酶體分離（化學處理法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移取xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養(yǎng)瓶的細胞（10⁸），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A）
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預冷的強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入xx毫升預冷的保存液（Reagent K），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移取上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心移取10毫升上清液到新的15毫升離心管
• 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體粗提沉淀物
• 加入xx毫升分離液（Reagent E），混勻沉淀顆粒群
• 準備1個6毫升超速離心管
• 移取xx毫升高純液A（Reagent F）到6毫升超速離心管底部（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent F)）
• 輕輕加上xx毫升高純液B（Reagent G）在高純液A（Reagent F）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent G)）
• 輕輕加上xx毫升高純液C（Reagent H）在高純液B（Reagent G）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液C(Reagent H)）
• 輕輕加上xx毫升高純液D（Reagent I）在高純液C（Reagent H）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液D(Reagent I)）
• 輕輕加上xx毫升高純液E（Reagent J）在高純液D（Reagent I）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液E(Reagent J)）
• 輕輕加上xx毫升上述溶酶體混勻液在高純液E（Reagent J）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心120分鐘，速度為145000g
• 小心收集頂部溶酶體樣品帶到15毫升錐形離心管——此步驟獲得高純溶酶體樣品
• 加入xx毫升預冷的保存液（Reagent K）
• 放進4℃超速離心機再次離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次（1克動物組織或 10⁸細胞）操作
• 所有操作均須嚴格在4℃或以下狀態(tài)進行
• 操作時，須戴手套
• 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、分離液（Reagent E）和高純液系列
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為40至80下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 對于難以裂解的細胞，例如HeLa細胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術處理

10． 使用高純液前，須搖勻后加入 

• 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整高純液的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 通常1克動物組織或 10⁸細胞的溶酶體含量為300微克左右溶酶體蛋白

13． 本產(chǎn)皮可以獲得99％以上純度的溶酶體  

• 溶酶體標志酶活性測定，建議使用通用型N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性比色法定量檢測試劑盒—70031.1和純化溶酶體酸性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒—50318.3 
• 溶酶體形態(tài)和功能染色，建議使用細胞溶酶體形態(tài)染色試劑盒—10121和純化溶酶體功能中性紅檢測試劑盒—10323 
• 本公司提供系列溶酶體分析試劑產(chǎn)品

質量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的溶酶體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的溶酶體維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶