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上海宸功生物技術有限公司
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細胞骨架(肌動蛋白微絲;F-ACTIN)綠色熒光染色試劑盒

時間:2017/1/17閱讀:7783
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HL10277.1 v.A

 

細胞骨架(肌動蛋白微絲;F-ACTIN)綠色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

細胞骨架(肌動蛋白微絲;F-ACTIN)綠色熒光染色試劑是一種旨在使用異硫氰酸熒光素標記的鬼筆環(huán)肽phalloidin,探尋細胞骨架絲狀肌動蛋白的分布和局部定向變化狀況的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種活體細胞(動物、人體、植物等)的細胞骨架裝配的檢測。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,反應敏感,操作簡捷,性能穩(wěn)定。

 

技術背景

 

肌動蛋白(actin)是42KD的球蛋白,構成細胞骨架的微絲(microfilament)和肌肉收縮裝置的細肌絲(thin filament),以及細胞膜表面?zhèn)巫悖?/span>pseudopodia微絨毛microvilli。肌動蛋白存在于所有真核生物細胞中,且高度進化保留,參與各種重要細胞功能,包括細胞遷移、細胞分裂、肌肉收縮、細胞形態(tài)維護、膜轉運(membrane trafficking) 等。哺乳動物具有六種異構體,分成α、β、γ三類。球狀肌動蛋白(G-actin)在生理條件下,組合成長絲聚合體,轉化為絲狀肌動蛋白(F-actin),形成細胞骨架的微絲。肌動蛋白的聚合與解聚的動態(tài)學變化是細胞骨架裝配(cytoskeleton assembly)的主要參數(shù)之一。鬼筆環(huán)肽phalloidin)是一種毒性菇類中分離的二環(huán)七肽bicyclic heptapeptide生物堿與聚合的微絲F-肌動蛋白結合,因此通過異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鬼筆環(huán)肽可以體外探測細胞F-肌動蛋白的分布和含量,據(jù)此分析細胞骨架裝配的調(diào)控機制。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液(Reagent A)        毫升

固著液(Reagent B)        毫升

通透液(Reagent C)        毫升

封阻液(Reagent D)        毫升

染色液(Reagent E)      微升

復染液(Reagent F)       微升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存染色液(Reagent E)和復染液(Reagent F)在-20℃冰箱里,避免反復凍融;其余的保存在4℃冰箱里,避免光照;有效保證6

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(12024):用于細胞脫離

*細胞培養(yǎng)液(12052):用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管:用于細胞染色的容器

(微型)臺式離心機:用于樣品操作

熒光(共聚焦)顯微鏡:用于細胞熒光觀察

 

實驗步驟

 

實驗開始前,將-20冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx微升通透液(Reagent C1.5毫升離心管,然后分別加入xx微升染色液(Reagent E復染液(Reagent F,混勻后,標記為染色工作液,置于冰槽里,放進暗室里備用。然后進行下列操作。

 

  • 直接法

 

  • 準備1個細胞培養(yǎng)6孔板,內(nèi)置1個細胞1 X 1 cm大小的載玻片
  • 接種待測細胞培養(yǎng),直至每孔鋪滿率達70 
  • 小心抽去細胞培養(yǎng)液
  • 輕輕加xx微清理液(Reagent A到細胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 小心抽去清理液(Reagent A
  • 輕輕加xx微固著液(Reagent B到細胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 小心抽去固著液(Reagent B
  • 輕輕加xx微通透液(Reagent C到細胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 小心抽去通透液(Reagent C
  • 輕輕加xx微封阻液(Reagent D到細胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 室溫下孵育30分鐘
  • 小心抽去封阻液(Reagent D
  • 輕輕加xx微清理液(Reagent A到細胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 小心抽去清理液(Reagent A
  • 重復實驗步驟14和15一次
  • 小心xx微升染色工作液 覆蓋樣品表面
  • 在暗室里室溫下孵育60分鐘
  • 小心抽去染色工作液
  • 輕輕加xx微清理液(Reagent A到細胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 小心抽去清理液(Reagent A
  • 封片
  • 即刻在熒光(共聚焦)顯微鏡下進行觀察(每個視野計數(shù)200個細胞)激發(fā)波長488nm,散發(fā)波長530nm(F-肌動蛋白染色)或激發(fā)波長350nm,散發(fā)波長460nm(細胞核色)――

綠色熒光顯示F-肌動蛋白;藍色熒光顯示細胞核為圓環(huán)或橢圓狀

 

  • 間接法

 

  • 準備125cm2細胞培養(yǎng)的待測細胞,直至鋪滿率達70%(約100萬細胞數(shù))
  • 小心移出細胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管(收集懸浮細胞)
  • 加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋細胞表面
  • 小心移出xx毫升清理液(Reagent A15毫升錐形離心管 
  • 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿細胞表面
  • 放進37培養(yǎng)箱孵育1分種
  • 輕輕手擊震動培養(yǎng),使細胞脫落
  • 加入3毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
  • 移入15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞可以由此步開始)
  • 放進臺式離心機離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微清理液(Reagent A,混勻
  • 轉入到1.5毫升離心管
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微固著液(Reagent B,混勻
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微通透液(Reagent C,混勻
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微封阻液(Reagent D,混勻
  • 室溫下孵育30分鐘
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微清理液(Reagent A,混勻
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升染色工作液
  • 200微升槍頭上下輕柔抽吸,混勻細胞顆粒群
  • 在暗室里室溫下孵育60分鐘 
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx清理液(Reagent A,混勻
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入200微升清理液(Reagent A,混勻
  • 即刻移取10微升在載玻片上壓片
  • 熒光(共聚焦)顯微鏡下進行觀察(每個視野計數(shù)200個細胞)激發(fā)波長488nm,散發(fā)波長530nm(F-肌動蛋白染色)或激發(fā)波長350nm,散發(fā)波長460nm(細胞核色)――

綠色熒光顯示F-肌動蛋白;藍色熒光顯示細胞核為圓環(huán)或橢圓狀

 

 

注意事項

 

  • 本產(chǎn)品為10次操作
  • 在整個操作過程中須戴手套,以防污染
  • 孵育時,必須避免光照
  • 建議檢測細胞量達106細胞數(shù)為佳
  • 用戶可以根據(jù)情況,適度調(diào)整試劑用量
  • 建議細胞染色完成后,即刻進行熒光分析,不宜超過1小時 
  • 注意:紫杉醇(PACLITAXEL),使F-肌動蛋白含量增加,熒光增強
  • 本公司提供系列細胞骨架檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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