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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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細(xì)胞骨架(肌動(dòng)蛋白微絲;F-ACTIN)綠色熒光染色試劑盒

時(shí)間:2017/1/17閱讀:7824
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HL10277.1 v.A

 

細(xì)胞骨架(肌動(dòng)蛋白微絲;F-ACTIN)綠色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

細(xì)胞骨架(肌動(dòng)蛋白微絲;F-ACTIN)綠色熒光染色試劑是一種旨在使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽phalloidin,探尋細(xì)胞骨架絲狀肌動(dòng)蛋白的分布和局部定向變化狀況的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于各種活體細(xì)胞(動(dòng)物、人體、植物等)的細(xì)胞骨架裝配的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,反應(yīng)敏感,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

肌動(dòng)蛋白(actin)是42KD的球蛋白,構(gòu)成細(xì)胞骨架的微絲(microfilament)和肌肉收縮裝置的細(xì)肌絲(thin filament),以及細(xì)胞膜表面?zhèn)巫悖?/span>pseudopodia微絨毛microvilli。肌動(dòng)蛋白存在于所有真核生物細(xì)胞中,且高度進(jìn)化保留,參與各種重要細(xì)胞功能,包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂、肌肉收縮、細(xì)胞形態(tài)維護(hù)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane trafficking) 等。哺乳動(dòng)物具有六種異構(gòu)體,分成α、β、γ三類。球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)在生理?xiàng)l件下,組合成長(zhǎng)絲聚合體,轉(zhuǎn)化為絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin),形成細(xì)胞骨架的微絲。肌動(dòng)蛋白的聚合與解聚的動(dòng)態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞骨架裝配(cytoskeleton assembly)的主要參數(shù)之一。鬼筆環(huán)肽phalloidin)是一種毒性菇類中分離的二環(huán)七肽bicyclic heptapeptide生物堿,與聚合的微絲F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合,因此通過異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以體外探測(cè)細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白的分布和含量,據(jù)此分析細(xì)胞骨架裝配的調(diào)控機(jī)制。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液(Reagent A)        毫升

固著液(Reagent B)        毫升

通透液(Reagent C)        毫升

封阻液(Reagent D)        毫升

染色液(Reagent E)      微升

復(fù)染液(Reagent F)       微升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存染色液(Reagent E)和復(fù)染液(Reagent F)在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融;其余的保存在4℃冰箱里,避免光照;有效保證6

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(12024):用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液(12052):用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管:用于細(xì)胞染色的容器

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品操作

熒光(共聚焦)顯微鏡:用于細(xì)胞熒光觀察

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx微升通透液(Reagent C1.5毫升離心管,然后分別加入xx微升染色液(Reagent E復(fù)染液(Reagent F,混勻后,標(biāo)記為染色工作液,置于冰槽里,放進(jìn)暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 直接法

 

  • 準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)6孔板,內(nèi)置1個(gè)細(xì)胞1 X 1 cm大小的載玻片
  • 接種待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)直至每孔鋪滿率達(dá)70 
  • 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
  • 輕輕加xx微清理液(Reagent A到細(xì)胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 小心抽去清理液(Reagent A
  • 輕輕加xx微固著液(Reagent B到細(xì)胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 小心抽去固著液(Reagent B
  • 輕輕加xx微通透液(Reagent C到細(xì)胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 小心抽去通透液(Reagent C
  • 輕輕加xx微封阻液(Reagent D到細(xì)胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 室溫下孵育30分鐘
  • 小心抽去封阻液(Reagent D
  • 輕輕加xx微清理液(Reagent A到細(xì)胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 小心抽去清理液(Reagent A
  • 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟14和15一次
  • 小心xx微升染色工作液, 覆蓋樣品表面
  • 在暗室里室溫下孵育60分鐘
  • 小心抽去染色工作液
  • 輕輕加xx微清理液(Reagent A到細(xì)胞載玻片上,覆蓋樣品表面
  • 小心抽去清理液(Reagent A
  • 封片
  • 即刻在熒光(共聚焦)顯微鏡下進(jìn)行觀察(每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞)激發(fā)波長(zhǎng)488nm,散發(fā)波長(zhǎng)530nm(F-肌動(dòng)蛋白染色)或激發(fā)波長(zhǎng)350nm,散發(fā)波長(zhǎng)460nm(細(xì)胞核色)――

綠色熒光顯示F-肌動(dòng)蛋白;藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀

 

  • 間接法

 

  • 準(zhǔn)備1個(gè)25cm2細(xì)胞培養(yǎng)的待測(cè)細(xì)胞,直至鋪滿率達(dá)70%(約100萬細(xì)胞數(shù))
  • 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管(收集懸浮細(xì)胞)
  • 加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋細(xì)胞表面
  • 小心移出xx毫升清理液(Reagent A15毫升錐形離心管 
  • 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿細(xì)胞表面
  • 放進(jìn)37培養(yǎng)箱孵育1分種
  • 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng),使細(xì)胞脫落
  • 加入3毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
  • 移入15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞可以由此步開始)
  • 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微清理液(Reagent A,混勻
  • 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微固著液(Reagent B,混勻
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微通透液(Reagent C,混勻
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微封阻液(Reagent D,混勻
  • 室溫下孵育30分鐘
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微清理液(Reagent A,混勻
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升染色工作液
  • 200微升槍頭上下輕柔抽吸,混勻細(xì)胞顆粒群
  • 在暗室里室溫下孵育60分鐘 
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx清理液(Reagent A,混勻
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g(或1500RPM,例如EPPENDORF 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入200微升清理液(Reagent A,混勻
  • 即刻移取10微升在載玻片上壓片
  • 熒光(共聚焦)顯微鏡下進(jìn)行觀察(每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞)激發(fā)波長(zhǎng)488nm,散發(fā)波長(zhǎng)530nm(F-肌動(dòng)蛋白染色)或激發(fā)波長(zhǎng)350nm,散發(fā)波長(zhǎng)460nm(細(xì)胞核色)――

綠色熒光顯示F-肌動(dòng)蛋白;藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀

 

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為10次操作
  • 在整個(gè)操作過程中須戴手套,以防污染
  • 孵育時(shí),必須避免光照
  • 建議檢測(cè)細(xì)胞量達(dá)106細(xì)胞數(shù)為佳
  • 用戶可以根據(jù)情況,適度調(diào)整試劑用量
  • 建議細(xì)胞染色完成后,即刻進(jìn)行熒光分析,不宜超過1小時(shí) 
  • 注意:紫杉醇(PACLITAXEL),使F-肌動(dòng)蛋白含量增加,熒光增強(qiáng)
  • 本公司提供系列細(xì)胞骨架檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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