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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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細(xì)胞IKKβ激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒

時(shí)間:2017/1/17閱讀:1427
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HL50162.3.3 v.A

          

 

細(xì)胞IKKβ激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

 

主要用途

 

細(xì)胞IKKβ激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過人工合成多肽底物,IKKβ激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下,受到IKKβ酸化后,進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng),測(cè)定產(chǎn)生ADP過程中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)的氧化反應(yīng), 即采用光度法測(cè)定其氧化后峰值的變化,以分析細(xì)胞裂解樣品中IKKβ特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)、部分或*純化酶樣品中IKKβ激酶的定量檢測(cè),以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,高度敏感。

 

技術(shù)背景

 

B細(xì)胞κ輕鏈多肽基因促動(dòng)子抑制劑激酶復(fù)合物(Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cellskinase complex;IκB kinase;IKK;EC 2.7.11.10),是NF-κB信號(hào)通路中的成員之一,由3個(gè)亞體構(gòu)成:IKKα,又稱為IKK1CHUKconserved helix-loop-helix ubiquitous kinase;IKKβ,又稱為IKK2或IKBKB;IKKγ,又稱為NEMO或IKBKG。ITI1、GPRK2L、GPRK4,屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家屬中鳥苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體激酶guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase;GRK)亞系成員之一。多基因GRK亞系由6個(gè)成員構(gòu)成,分成3類:包括GRK1(視網(wǎng)膜色素激酶家系;rhodopsin kinase)、GRK2/3β腎上腺素能受體激酶;β-adrenergic receptor kinase)以及IKK/5/6IKK激酶)。其中G蛋白偶聯(lián)受體激酶4至少有4種變異體:IKKα、β、γ、δ,在組織中高度表達(dá)。IKK使G蛋白偶聯(lián)受體,例如多巴胺等去敏化(desensitization)、以及授精等有關(guān)。其目標(biāo)蛋白為活化的G-蛋白偶聯(lián)受體蛋白,進(jìn)行磷酸化后,抑制其功能。功能異常將導(dǎo)致遺傳性或獲得性高血壓等疾病。其磷酸化目標(biāo)序列為RRREEEEESAAA。基于底物RRREEEEESAAA,IKKβ激酶敏感性抑制劑5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺((5-phenyl-3-ureido)-thiophene-2-carboxamide)存在與否的情況下,受到IKKβ激酶的磷酸化,獲得產(chǎn)物磷酸化多肽,進(jìn)而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase;LDH)反應(yīng)系統(tǒng)中,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD),其吸光峰值的變化340nm,來定量分析IKKβ的特異活性。其反應(yīng)方式為:

 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液(Reagent A)  毫升

裂解液(Reagent B)  毫升

緩沖液(Reagent C)  毫升

酶促液(Reagent D)  微升

反應(yīng)液(Reagent E)  微升

底物液(Reagent F)  微升

陰性液(Reagent G)  微升

專性液(Reagent H)  微升

產(chǎn)品說明書       1份

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A)4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里,嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融;有效保證6

 

用戶自備

 

IKKβ激酶:用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒:用于貼壁細(xì)胞脫離

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于組織預(yù)處理

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于樣品光度分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

  • 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞(15 X 107細(xì)胞)
  • 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋生長(zhǎng)表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:避免使用胰酶消化
  • 加入xx毫升清理液(Reagent A,混勻細(xì)胞
  • 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開始
  • 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混勻
  • 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 強(qiáng)力渦旋震蕩15
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-HL30030.1
  • 即刻放進(jìn)-70保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

  • 測(cè)定準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如細(xì)胞裂解懸液等),置于冰槽里 
  • 設(shè)定好分光光度儀(溫度為30℃):波長(zhǎng)為340nm,間隔1分鐘,讀數(shù)6次(共5分鐘),并置零
  • 緩沖液(Reagent C室溫下均衡溫度

 

  • 背景對(duì)照測(cè)定

 

  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent E
  • 加入xx微升底物液(Reagent F
  • 放進(jìn)30培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
  • 加入xx微升陰性液(Reagent G
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照:340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

 

  • 樣品總活性測(cè)定

 

  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent E
  • 加入xx微升底物液(Reagent F
  • 放進(jìn)30培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
  • 加入5微升待測(cè)樣品(注意:50微克細(xì)胞裂解蛋白;樣品須溶解
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品總活性讀數(shù):340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘 

 

  • 樣品非特異活性測(cè)定

 

檢測(cè)開始前,移取xx微升緩沖液(Reagent C到1.5毫升離心管,分別加入xx微升專性液(Reagent H)待測(cè)樣品(注意:50微克細(xì)胞裂解蛋白),混勻后,放進(jìn)30培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

 

  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent E
  • 加入xx微升底物液(Reagent F 
  • 放進(jìn)30培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
  • 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品非特異活性讀數(shù):340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

 

  • 計(jì)算樣品活性

 

  • 樣品總活性和非特異活性計(jì)算

 

 

2)樣品特異活性計(jì)算

 

 

七、酶標(biāo)儀測(cè)定

 

1)樣品總活性測(cè)定

  • 96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品
  • 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C到96孔板
  • 分別加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 分別加入xx微升反應(yīng)液(Reagent E
  • 分別加入xx微升底物液(Reagent F
  • 輕輕搖動(dòng)96孔板
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 分別加入xx微升陰性液(Reagent G待測(cè)樣品(50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白)到相應(yīng)孔(注意:樣品須清澈
  • 輕輕搖動(dòng)96孔板
  • 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
  • 活性計(jì)算:

 

 

  • 樣品非特異活性測(cè)定

 

檢測(cè)開始前,移取xx微升緩沖液(Reagent C到1.5毫升離心管,分別加入xx微升專性液(Reagent H)待測(cè)樣品(注意:50微克細(xì)胞裂解蛋白),混勻后,放進(jìn)30培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

  • 96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:待測(cè)樣品
  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到96孔板
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent E
  • 加入xx微升底物液(Reagent F 
  • 輕輕搖動(dòng)96孔板
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
  • 輕輕搖動(dòng)96孔板
  • 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
  • 活性計(jì)算:

 

 

  • 樣品特異活性計(jì)算

 

 

八、抑制劑篩選

 

  • 96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景、*活性和待測(cè)抑制劑樣品
  • 按下表加入試劑,進(jìn)行樣品預(yù)處理

 

內(nèi)容物

空背景對(duì)照

樣本背景

*酶活性

待測(cè)抑制劑酶活性

緩沖液(Reagent C

xx微升

xx微升

xx微升

xx微升

陰性液(Reagent G)

xx微升

xx微升

xx微升

——

待測(cè)抑制劑

——

xx微升

――

xx微升

用戶自備的純化酶

——

——

xx微升(1毫單位)

xx微升(1毫單位)

96孔板每孔總量

空背景對(duì)照

xx微升)

樣本背景孔

xx微升)

*活性

xx微升)

待測(cè)抑制劑樣品

xx微升)

輕輕搖動(dòng)96孔板,混勻,放進(jìn)30培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作

 

  • 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C新的96孔板的所有
  • 分別加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 分別加入xx微升反應(yīng)液(Reagent E
  • 分別加入xx微升底物液(Reagent F 
  • 輕輕搖動(dòng)96孔板
  • 在30溫度下孵育3分鐘
  • 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
  • 即刻放進(jìn)30酶標(biāo)儀檢測(cè):測(cè)讀30分鐘
  • 抑制活性計(jì)算:

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為25次操作,包括背景操作
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 系統(tǒng)操作過程中,背景測(cè)定只需1
  • 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
  • 樣品須澄清,至關(guān)重要 
  • 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定
  • 測(cè)定值由高到低變化;測(cè)定可持續(xù)30分鐘
  • 光度測(cè)定后,比色皿須清洗*
  • 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
  • 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升(本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-HL30030.1)
  • 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
  • 可以使用IKKβ抑制劑作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
  • IKKβ活性單位濃度定義:在30溫度下,pH 7.5條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作為一個(gè)活性單位
  • 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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