HL10112.2 v.A

純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧（ROS）魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過自由基探針魯米諾和強(qiáng)化劑的參與下，線粒體樣品中的活性氧族使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光，在化學(xué)發(fā)光儀（Luminometer）的幫助下定量檢測樣品中活性氧族（過氧化氫）的生成和數(shù)量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種生物體線粒體組分的活性氧族的檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。線粒體是真核細(xì)胞的膜性細(xì)胞器，是產(chǎn)生活性氧、進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的重要場所。魯米諾（luminol），又稱氨基鄰苯二甲酰肼（luminol；3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一種脂溶性的發(fā)光劑，氧化后生成魯米諾自由基而化學(xué)發(fā)光，具有460nm左右峰值的帶狀光譜，肉眼可觀察到鮮明的紫藍(lán)色。魯米諾以單價氧化形式與超氧自由基陰離子反應(yīng)，產(chǎn)生不穩(wěn)定性內(nèi)過氧化物或二氧環(huán)丁烷（Dioxetane），由此分解成電激發(fā)狀態(tài)，通過釋放光子，回復(fù)到基態(tài)。魯米諾作為探針，可以檢測線粒體中過氧化氫、超氧自由基陰離子和羥自由基，其中過氧化氫zui強(qiáng)，其發(fā)光強(qiáng)度與過氧化氫水平成正相關(guān)。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）      毫升

強(qiáng)化液（Reagent B）      毫升

發(fā)光液（Reagent C）      毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存強(qiáng)化液（Reagent B）和發(fā)光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于樣品孵育

微型臺式離心機(jī)：用于去除樣品雜質(zhì)

測試管或黑色96孔板：用于發(fā)光檢測用的容器

化學(xué)發(fā)光儀：用于檢測化學(xué)發(fā)光

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品預(yù)處理

• 移取100微升新鮮制備（2小時內(nèi)）的純化線粒體（400微克線粒體蛋白）到預(yù)冷的1.5毫升離心管，置于冰槽里
• 加入xx微升清理液（Reagent A），輕輕混勻線粒體
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育10分鐘
• 加入10微升用戶自備的待測藥品
• 即刻進(jìn)入下列測讀操作

• 測讀

測讀開始前，打開化學(xué)發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為37℃預(yù)熱和整合測讀10秒或 15分鐘；然后關(guān)掉實(shí)驗(yàn)室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴(yán)格置于暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好測試管，做好標(biāo)記：陰性對照、樣品本底和樣品活性
• 移取xx微升清理液（Reagent A）到陰性對照測試管
• 移取400微升上述預(yù)處理的待測線粒體到樣品本底測試管
• 移取400微升上述預(yù)處理的待測線粒體到樣品活性測試管
• 分別加入xx微升強(qiáng)化液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管外
• 分別加入xx微升發(fā)光液（Reagent C）到上述測試管，除樣品本底測試管外
• 輕輕渦旋混勻
• 即刻放進(jìn)37℃化學(xué)發(fā)光儀里測讀
• 整合測讀10秒，獲得相對發(fā)光單位（relative light unit；RLU）
• 或者整合測讀15分鐘，獲得光電子讀數(shù)：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液體閃爍儀替代）
• 計(jì)算ROS水平：

 注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 操作時，須戴手套
• 測試前，線粒體分離后2小時內(nèi)為
• 線粒體懸液須在4℃溫度下保存?zhèn)溆?/span>
• 如果測定體系變化，則試劑用量相應(yīng)變化
• 系統(tǒng)操作過程中，陰性對照只需測定一次
• 測讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行
• 如果是注射式化學(xué)發(fā)光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學(xué)發(fā)光儀注射（injector）管道
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感