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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶活性熒光定量檢測試劑盒

時(shí)間:2017/1/18閱讀:2967
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細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶(REVERSE TRANSCRIPTASE)活性熒光定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書(中文版)

 

主要用途

 

細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶(REVERSE TRANSCRIPTASE)活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過雙鏈分子底物,在dTTP的參與下,通過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化,聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子,由PicoGreen特異染色,即采用熒光法來測定細(xì)胞裂解樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液樣品(動(dòng)物、人體、昆蟲等)逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,以及抑制劑檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

逆轉(zhuǎn)錄酶(REVERSE TRANSCRIPTASE;EC2.7.7.49),又稱為RNA依賴性DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase),是將單鏈RNA分子轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA的DNA聚合酶,包括HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus;MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus;AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(omerase reverse transcriptase) 等。逆轉(zhuǎn)錄病毒使用逆轉(zhuǎn)錄酶達(dá)到逆轉(zhuǎn)錄RNA為DNA,然后整合到宿主基因組再復(fù)制。在真核生物中,端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶在分子生物學(xué)中得到廣泛運(yùn)用。檢測逆轉(zhuǎn)錄酶活性成為病毒感染的監(jiān)測手段,同時(shí)作為藥物篩選的靶標(biāo)。基于由poly-A模板與oligo-dT引物構(gòu)成的雙鏈分子底物,在dTTP的參與下,通過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化,聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子(heteroduplexes),由PicoGreen特異染色,根據(jù)熒光強(qiáng)度分析(激發(fā)波長480nm,散發(fā)波長520nm),來定量測定逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液(Reagent A)

毫升

裂解液(Reagent B)

毫升

緩沖液(Reagent C)

毫升

底物液(Reagent D)

微升

終止液(Reagent E)

微升

染色液(Reagent F)

微升

稀釋液(Reagent G)

毫升

標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent H)

微升

產(chǎn)品說明書

1份

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A)4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里;染色液(Reagent F避免光照;有效保證6

 

 

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒:用于細(xì)胞脫離

DOUNCE勻漿器:用于裂解組織

臺(tái)式離心機(jī):用于樣品操作

比色皿或酶標(biāo)板:用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀:用于熒光分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液(Reagent B置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 樣品準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞(15 X 106細(xì)胞)
  • 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋生長表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入xx毫升清理液(Reagent A,混勻細(xì)胞
  • 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開始
  • 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B 
  • 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒,充分混勻
  • 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
  • 在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約80下)
  • 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
  • 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為10000g
  • 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
  • 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測
  • 放進(jìn)-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

  • 測定準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好待測樣品(例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等),置于冰槽里
  • 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀(溫度為25℃):激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長520nm
  • 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管,標(biāo)記為15號(hào)管
  • 分別加入xx微升裂解液(Reagent B15號(hào)管
  • 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent H1號(hào)管,混勻
  • 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent H2號(hào)管,混勻
  • 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent H3號(hào)管,混勻
  • 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent H4號(hào)管,混勻
  • 15號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用;標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

管號(hào)

裂解液(Reagent B

標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent H

測定體系標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度

1

xx微升

xx微升

xx納克/毫升

2

xx微升

xx微升1號(hào)管

xx納克/毫升

3

xx微升

xx微升2號(hào)管

xx納克/毫升

4

xx微升

xx微升3號(hào)管

xx納克/毫升

5

xx微升

0

0

 

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

 

測定開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(Reagent F置入冰槽里融化,然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管,加入xx微升稀釋液(Reagent G,輕柔混勻后,置于冰槽里,標(biāo)記為反應(yīng)工作液(注意:5次操作量),放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作

 

  • 96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:標(biāo)準(zhǔn)樣品
  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到96孔板應(yīng)孔
  • 分別加入xx微升底物液(Reagent D
  • 分別加入5微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
  • 分別加入xx微升終止液(Reagent E
  • 分別加入xx微升染色工作液
  • 室溫下孵育5分鐘,避免光照
  • 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測:獲得相對熒光讀數(shù)RFU(Relative Fluorescence Unit
  • 實(shí)際熒光讀數(shù):標(biāo)準(zhǔn)樣品相對熒光讀數(shù)-5號(hào)管標(biāo)準(zhǔn)樣品相對熒光讀數(shù)(作為背景空對照)
  • 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為實(shí)際熒光單位RFU;橫座標(biāo)(X軸)為標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度(納克/毫升

 

四、樣品測定

 

測定開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(Reagent F置入冰槽里融化,然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管,加入xx微升稀釋液(Reagent G,輕柔混勻后,置于冰槽里,標(biāo)記為反應(yīng)工作液(注意:5次操作量),放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作

 

  • 96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:待測樣品
  • 移取xx微升緩沖液(Reagent C到96孔板應(yīng)孔
  • 加入xx微升底物液(Reagent D
  • 加入5微升待測樣品(注意:10微克純化酶蛋白或50微克裂解懸液蛋白)
  • 室溫下孵育60分鐘
  • 分別加入xx微升終止液(Reagent E
  • 分別加入xx微升染色工作
  • 室溫下孵育5分鐘,避免光照
  • 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測:獲得相對熒光讀數(shù)RFU(Relative Fluorescence Unit
  • 實(shí)際熒光讀數(shù):待測樣品相對熒光讀數(shù)-5號(hào)管標(biāo)準(zhǔn)樣品相對熒光讀數(shù)(作為背景空對照)
  • 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)DNA濃度(納克/毫升
  • 實(shí)際活性計(jì)算:

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為20次操作
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 系統(tǒng)操作過程中,標(biāo)準(zhǔn)曲線測定只需1次
  • 樣品須澄清,至關(guān)重要
  • 樣品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100
  • 反應(yīng)完成即刻進(jìn)行熒光測定
  • 測定值由變化
  • 樣本測定樣品讀數(shù)背景讀數(shù)表明具有酶活性
  • 待測樣本為粗提酶樣品,其蛋白濃度為10微克/5微升;待測樣本為細(xì)胞裂解懸液,其蛋白濃度為50微克/5微升
  • 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
  • 逆轉(zhuǎn)錄酶單位活性定義為:在25℃,pH 8.1條件下,每小時(shí)內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄1納克DNA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
  • 本公司提供系列逆轉(zhuǎn)錄酶檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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