細(xì)菌β-半乳糖苷酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

細(xì)菌β-半乳糖苷酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用化學(xué)方法，快速有效地裂解細(xì)菌細(xì)胞，通過高速離心，獲得澄清細(xì)菌裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應(yīng)體系里，以鄰硝基苯基-β-D- 半乳糖苷為無色底物，水解所產(chǎn)生的亮黃色的鄰硝基酚，即采用比色法定量測(cè)定細(xì)菌裂解懸液制備樣品中的β-半乳糖苷酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它分子生物學(xué)研究。其適用于活體細(xì)菌內(nèi)源性或外源性β-半乳糖苷酶活性分析。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，參數(shù)優(yōu)化，操作簡(jiǎn)便、比色敏感，堪稱上同類產(chǎn)品zui為上佳。

技術(shù)背景

大腸桿菌的標(biāo)志基因Lac Z編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可從乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常穩(wěn)定，對(duì)蛋白水解降解作用抗性強(qiáng)，且容易測(cè)試。因此β-半乳糖苷酶成為目前zui常用的報(bào)告基因，以評(píng)價(jià)載體轉(zhuǎn)染的效果。鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyraniside；ONPG），是一種無色底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶的催化下，水解成無色的半乳糖和亮黃色的鄰硝基酚（o-nitrophenol；ONP），通過420nm波長(zhǎng)的吸光值分析，來測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性單位。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿：用于比色分析的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

計(jì)時(shí)器：用于反應(yīng)計(jì)時(shí)

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，開啟分光光度儀預(yù)熱，設(shè)置波長(zhǎng)420nm；開啟恒溫水槽，設(shè)置溫度為37℃。同時(shí)從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent D）置于冰槽里融化反應(yīng)液（Reagent D）避免光照。然后進(jìn)行下列操作：

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好10毫升待測(cè)的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí)，速度為220RPM
• 移取500微升過夜培養(yǎng)的細(xì)菌到15毫升錐形離心管
• 加入用戶自備的10毫升新鮮培養(yǎng)液和誘導(dǎo)劑
• 放進(jìn)37℃搖床孵育2小時(shí)，速度為220RPM（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 加入xx微升活性液（Reagent B）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 活性檢測(cè)

方法一：常規(guī)檢測(cè)（比色皿）

• 移取100微升上述制備的細(xì)菌細(xì)胞裂解懸液樣品到新的比色皿
• 加入xx微升稀釋液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育5分鐘
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）（注意：使用前，充分混勻反應(yīng)液（Reagent D）中可能的沉淀） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻，同時(shí)開啟計(jì)時(shí)器進(jìn)行計(jì)時(shí)
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育至少10分鐘，或直至出現(xiàn)亮黃色（注意：參見注意事項(xiàng)14）
• 加入xx微升終止液（Reagent E），同時(shí)關(guān)閉計(jì)時(shí)器結(jié)束計(jì)時(shí)
• 記錄反應(yīng)所用的實(shí)際時(shí)間

10.  即刻放入分光光度儀檢測(cè)，記錄樣品吸光讀數(shù)

方法二：微量檢測(cè)（酶標(biāo)板） 

• 移取10微升上述制備的細(xì)菌細(xì)胞裂解懸液樣品到酶標(biāo)板中的1個(gè)孔里
• 加入xx微升稀釋液（Reagent C）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板數(shù)次，混勻
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育5分鐘
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）（注意：使用前，充分混勻反應(yīng)液（Reagent D）中可能的沉淀） 
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板數(shù)次，混勻，同時(shí)開啟計(jì)時(shí)器進(jìn)行計(jì)時(shí)
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育至少10分鐘，直至出現(xiàn)亮黃色（注意：參見注意事項(xiàng)14）
• 加入xx微升終止液（Reagent E），同時(shí)關(guān)閉計(jì)時(shí)器結(jié)束計(jì)時(shí)
• 記錄反應(yīng)所用的實(shí)際時(shí)間
• 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，記錄樣品吸光讀數(shù)，

• 菌落直接檢測(cè)

• 移取xx微升裂解液（Reagent A）到1.5毫升離心管
• 加入xx微升稀釋液（Reagent C）
• 使用牙簽、200微升槍頭或接種環(huán)挑選1個(gè)完整菌落
• 渦旋震蕩15秒，混勻
• 放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，波長(zhǎng)為600nm，記錄讀數(shù)
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育5分鐘
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）（注意：使用前，充分混勻反應(yīng)液（Reagent D）中可能的沉淀） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻，同時(shí)開啟計(jì)時(shí)器進(jìn)行計(jì)時(shí)
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育至少10分鐘，直至出現(xiàn)亮黃色（注意：參見注意事項(xiàng)14）
• 加入xx微升終止液（Reagent E），同時(shí)關(guān)閉計(jì)時(shí)器結(jié)束計(jì)時(shí)
• 記錄反應(yīng)所用的實(shí)際時(shí)間
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心30秒，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到比色皿
• 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，記錄樣品吸光讀數(shù)，

• 計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）操作
• 建議使用核內(nèi)表達(dá)的載體代替胞內(nèi)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞或組織
• 本產(chǎn)品的各項(xiàng)參數(shù)達(dá)到*化
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行
• 操作時(shí)，須戴手套
• 反應(yīng)液（Reagent D）避免光照和反復(fù)凍融
• 用戶可以測(cè)定細(xì)胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計(jì)算活性單位之需
• 如果用戶需要測(cè)定背景空對(duì)照，可以*按照活性檢測(cè)的操作步驟進(jìn)行，*變化在于100微升樣品改成100微升裂解液（Reagent A）替代
• 如果用戶測(cè)得背景空對(duì)照，計(jì)算活性時(shí)，勿忘（樣品吸光讀數(shù)－背景空對(duì)照讀數(shù)）
• 反應(yīng)孵育時(shí)間的理想范圍為10分鐘至60分鐘內(nèi)出現(xiàn)亮黃色顯色：低于5分鐘表明酶活性過高，建議稀釋樣品，否則影響檢測(cè)精度；大于60分鐘表明酶活性較低，建議增加樣品量，不要增加孵育時(shí)間
• 如果增加孵育時(shí)間3小時(shí)以上，可能產(chǎn)生反應(yīng)底物的自動(dòng)水解，影響檢測(cè)精度
• 如果用戶樣品有限，轉(zhuǎn)染困難，且酶活性過低，必須大量增加孵育時(shí)間
• 樣品的酶活性吸光值在0.1至1.2 OD單位為理想狀態(tài)，其酶活性與吸光值成線性正相關(guān)；吸光值在0.3至0.9 OD單位為狀態(tài)
• 亮黃色顯色的標(biāo)準(zhǔn)為等同于新鮮的LB培養(yǎng)液作為色彩參照，同時(shí)作為反應(yīng)終止的標(biāo)準(zhǔn)
• 反應(yīng)終止后，即刻進(jìn)行比色測(cè)定
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾的鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷
• 本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感